金麗梅 隋世有 任夢雅 白 靜4 牛廣財3 李志江2

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

豆類中含有豐富的花色苷、蛋白質(zhì)和多酚等物質(zhì)，而花色苷是天然的抗氧化劑，有著極強的清除自由基的能力，與合成色素相比具有安全無毒、天然健康等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于藥品、食品和化妝品中[1-3]。目前，有關(guān)豆類花色素的研究主要集中在豆類花色素分離純化、色素穩(wěn)定性及其抗氧化活性[4]。Amarowicz等[5]發(fā)現(xiàn)紅豆種皮中含有大量兒茶素葡萄糖苷、槲皮素葡糖苷等多酚類物質(zhì)。紅小豆種皮“紅色”物質(zhì)為“花色素”，主要成分為3，5，7-三羥基花(色)苷[6]，是多元酚的一種，該色素色澤自然，對食品的口感、風(fēng)味無影響[7-8]。

目前，紅小豆種皮色素的分離純化方法主要有大孔樹脂吸附[9]、柱層析[10]和膜分離技術(shù)[11]等。大孔樹脂吸附法和柱層析法存在工藝相對粗糙、產(chǎn)品純度低、有機溶劑殘留、成本較高[12-13]等問題。膜分離技術(shù)具有效率高、操作方便、節(jié)能等優(yōu)點，與其他傳統(tǒng)分離技術(shù)相比，其具有顯著優(yōu)勢。近年來，膜分離技術(shù)在熱敏性食品物料濃縮方面的應(yīng)用越來越廣泛[14]。李媛媛等[15]研究表明，微濾和納濾聯(lián)用能夠在常溫下純化和濃縮梔子黃色素且色素?fù)p失率較低，是梔子黃色素工業(yè)化生產(chǎn)較為理想的工藝。胡建農(nóng)等[16]采用微濾聯(lián)合納濾對玫瑰茄紅色素浸提液進行分離純化，其產(chǎn)品色價高、純度高、穩(wěn)定性好。試驗擬以水為浸提劑，對紅小豆種皮色素的提取條件及膜分離純化工藝進行研究，確定最佳工藝條件及分離純化方法，旨在為色素的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅小豆：市售；

氯化鉀、鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉、冰乙酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

福林酚試劑、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸緩沖溶液：分析純，福州飛凈生物科技有限公司；

沒食子酸、葡萄糖、濃硫酸：分析純，遼寧全瑞試劑有限公司；

苯酚：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑公司；

碳酸氫鈉：分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司；

去離子水：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院中試車間；

離心機：L420型，湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司；

磁力攪拌器：EMS-13型，天津市歐諾儀器儀表有限公司；

電子分析天平：JD4000-2型，沈陽龍騰電子有限公司；

旋片式真空泵：XZ-1B型，溫嶺市力拓機電有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-2A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高速萬能粉碎機：FW-100型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州榮華儀器制造有限公司；

分光光度計：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

真空冷凍干燥機：Alpha 1-4 LSCbasic 型，廣州倍立思儀器有限公司；

試驗用膜分離裝置：NF-UF-MF-4020型，其中微濾膜為管式陶瓷膜(0.22 μm)，膜面積0.05 m2，納濾膜為卷式聚酰胺膜，膜型號分別為NF90(切割分子量MWCO 100 Da左右)、NF245(MWCO 200 Da左右)和NF270(MWCO 300～400 Da)，膜面積0.4 m2，超濾膜為卷式聚醚砜膜，其切割分子量分別為10，30，50，100 kDa，上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

紅小豆挑選→清洗→脫皮→晾干→粉碎→浸提→抽濾→離心→微濾→納濾→紅豆色素

1.2.2 紅小豆種皮色素提取單因素試驗 將紅小豆清洗干凈并去除雜質(zhì)，用去離子水浸泡12 h，手工脫皮后于60 ℃ 鼓風(fēng)干燥箱烘干2 h，粉碎。使用去離子水作為溶劑進行色素提取[7]，優(yōu)化料液比、浸提溫度和浸提時間等工藝參數(shù)，得到不同色素含量的提取液。將色素提取液真空抽濾，3 500 r/min離心10 min，取上清液進行過濾，用移液管吸取1 mL濾液，用少量去離子水稀釋，移入10 mL 容量瓶中定容，以蒸餾水為參比，測定404 nm處吸光度。

根據(jù)文獻[17-18] 可知，中性和弱堿性的水適宜提取紅小豆種皮中的紅褐色素，酸性環(huán)境適宜提取紫紅色素，且pH 值為5～8 時色素顏色比較穩(wěn)定?？紤]到中性條件不論是在實驗室階段，還是工業(yè)化生產(chǎn)中均比較容易實現(xiàn)，因此在中性條件下進行色素提取。

(1) 料液比對紅小豆種皮色素提取量的影響：稱取一定質(zhì)量的紅小豆種皮粉末，按料液比(m紅小豆種皮∶V水)分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70 (g/mL)加入去離子水，浸提溫度60 ℃，浸提時間40 min，考察料液比對紅小豆種皮色素提取量的影響。

(2) 浸提溫度對紅小豆種皮色素提取量的影響：稱取一定質(zhì)量的紅小豆種皮粉末，固定料液比(m紅小豆種皮∶V水)為1∶30 (g/mL)，調(diào)節(jié)浸提溫度分別為40，50，60，70，80，90 ℃，浸提時間40 min，考察浸提溫度對紅小豆種皮色素提取量的影響。

(3) 浸提時間對紅小豆種皮色素提取量的影響：稱取一定質(zhì)量的紅小豆種皮粉末，固定料液比(m紅小豆種皮∶V水)為1∶30 (g/mL)、浸提溫度80 ℃，調(diào)節(jié)浸提時間分別為40，50，60，70，80，90 min，考察浸提時間對紅小豆種皮色素提取量的影響。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以紅小豆種皮色素提取量為指標(biāo)，在料液比、浸提溫度、浸提時間3個因素中選取3個較優(yōu)水平，按照L9(33)正交優(yōu)化得到紅小豆種皮色素的最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.4 膜分離試驗 將紅小豆種皮粗提液置于料液桶中(見圖1)，啟動輸液泵將料液以切向流方式通過膜組件，控制透過液體積達到原料液體積60%，即回收率為60%時停止試驗，分別收集透過液和濃縮液進行指標(biāo)測定，并進行相關(guān)計算。

1.原料液槽 2.輸液泵 3.壓力表 4.膜過濾組件 5.流量計 6.循環(huán)閥 7.濃液閥 8.流量計閥圖1 NF-UF-MF-4020試驗用膜分離裝置Figure 1 NF-UF-MF-4020 laboratory membrane separation device

(1) 膜篩選：紅豆皮色素提取液中含有蛋白質(zhì)、可溶性淀粉、糖類等物質(zhì)，為得到純度相對較高的色素，對膜種類及型號進行篩選。膜裝置中配置不同規(guī)格的膜組件，包括微濾膜(0.22 μm)、切割分子量為10，30，50，100 kDa 的超濾膜和納濾膜(NF90)，壓力0.1 MPa，使色素浸提液分別通過上述6種不同膜組件，收集原料液和透過液并用pH試差法測定吸光度，計算色素透過率。

(2) 微濾操作壓力優(yōu)化：膜裝置中安裝孔徑為0.22 μm 的微濾膜組件，料液桶中放入色素提取液，啟動膜裝置并調(diào)節(jié)壓力分別為0.025，0.050，0.075，0.100 MPa，過濾，收集透過液，計算膜通量和色素透率，確定較優(yōu)的操作壓力。

(3) 納濾操作壓力優(yōu)化：將不同切割分子量的納濾膜(NF90、NF245和NF270)安裝于膜組件中，將微濾透過液倒入料液桶重復(fù)1.2.4(2)操作，壓力分別控制為0.1，0.2，0.3，0.4 MPa，過濾，分別收集透過液和濃縮液進行指標(biāo)測定，計算膜通量和色素透過率。

(4) 微濾—納濾聯(lián)合技術(shù)對紅小豆色素的分離純化：采用孔徑為0.22 μm 的微濾膜，于0.075 MPa下處理色素提取液，將透過液重新倒入料液桶中，使用NF245納濾膜繼續(xù)處理，此時操作壓力為0.3 MPa，分別收集微濾和納濾處理前后的樣品，測定404 nm處吸光度，計算色價和花色苷質(zhì)量濃度，并測定其蛋白質(zhì)、總糖、酚含量，納濾截留液經(jīng)真空冷凍干燥后得到固體粉末。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 色素提取量 根據(jù)文獻[19]以色素提取量為評價指標(biāo)，并按式(1)進行計算。

Q=A×V，

(1)

式中：

Q——提取量，mL；

A——色素提取液吸光度；

V——提取時所用溶劑體積，mL。

1.3.2 色價 根據(jù)文獻[20]，按式(2)計算色素色價。

(2)

式中：

A——404 nm處吸光度；

f——稀釋倍數(shù)；

m——所取樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 花色苷質(zhì)量濃度 采用pH示差法[21]。并按式(3) 計算花色苷質(zhì)量濃度。

(3)

式中：

C——花色苷質(zhì)量濃度，mg/L；

A——吸光度差值，A=(A520 nm-A700 nm)pH 1.0-(A520 nm-A700 nm)pH 4.5；

MW——矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，g/mol；

DF——稀釋倍數(shù)；

1——光路長，cm；

ε——矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，L/(mol·cm)。

1.3.4 總酚含量 采用福林酚法[22]。

1.3.5 總糖含量 采用苯酚—硫酸法[23]。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量 采用考馬斯亮藍法[24]。

1.3.7 膜性能

(1) 膜通量：在膜過濾系統(tǒng)中加入色素浸提液，并按式(4)計算膜通量。

J=ΔV/(S·Δt)，

(4)

式中：

J——膜通量，L/(m2·h)；

ΔV——取樣時間內(nèi)透過液體積，L；

S——膜面積，m2；

Δt——取樣時間，h。

(2) 透過率：按式(5)計算微濾或納濾膜各組分的透過率。

(5)

式中：

P——透過率，%；

c2——透過液中某物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/L；

c1——進料液中某物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以x±s表示，使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素浸提單因素試驗

在料液比(m紅小豆種皮∶V水)為1∶30 (g/mL)，浸提溫度80 ℃，浸提時間40 min的試驗條件下，當(dāng)提取次數(shù)為1時，花色苷提取量約為40.62 mL；當(dāng)提取次數(shù)為2，3時，其提取量分別為7.44，6.35 mL，此時紅小豆種皮變成糊狀，提取操作不易進行且花色苷含量很低，因此在后續(xù)研究中提取次數(shù)均為1次。由圖2可知，當(dāng)紅小豆種皮用量一定時，溶劑用量越多，越利于色素從豆皮表面向溶劑本體擴散，色素提取量逐漸升高。當(dāng)料液比(m紅小豆種皮∶V水)為1∶30 (g/mL)時，紅小豆種皮花色苷提取量達最大值39.43 mL，此時若再增加料液比，浸出色素量不再增加，同時溶解帶出的水溶性雜質(zhì)會降低吸光值[25]。浸提溫度越高，植物組織軟化膨脹速度越快，色素從豆皮組織內(nèi)部向其表皮和溶劑本體擴散速度增加，色素提取量逐漸增加，故紅小豆色素提取的最佳浸提溫度為80 ℃，龔金華等[26]研究表明以水為溶劑浸提色素在80 ℃左右時耐熱性更好。當(dāng)浸提時間為40～80 min時，色素提取量隨浸提時間的增加逐漸上升，80 min時提取量達最大值，故浸提時間控制在80 min。

圖2 各因素對紅小豆種皮色素提取量的影響Figure 2 Effect of ratio of different factors on extraction amount of pigment

2.2 紅色素浸提工藝優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用L9(33)正交試驗設(shè)計表，對影響吸光度值的因素進行優(yōu)化，正交試驗因素水平表見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，各因素對紅小豆種皮色素浸提過程中吸光度影響的主次順序為料液比>浸提時間>浸提溫度，最佳優(yōu)化工藝組合為A2C3B3，即料液比(m紅小豆種皮∶V水)1∶30 (g/mL)、浸提時間90 min、浸提溫度90 ℃，此時色素提取量為49.05 mL(n=3)，說明此方法穩(wěn)定可行。

表2 L9(33)正交試驗表Table 2 L9(33) Orthogonal experiment table

2.3 膜純化工藝優(yōu)化

2.3.1 膜篩選 通過試驗得到不同膜過程對應(yīng)的色素透過率如表3所示。由表3可知，超濾膜的切割分子量越大，色素透過率越大，微濾膜(0.22 μm)和超濾(MWCO 100 kDa)對應(yīng)的色素透過率分別為78.7%，20.1%，因此選取微濾(0.22 μm)膜對色素提取液中大分子物質(zhì)進行初步分離。張小曼等[20]研究表明微濾預(yù)處理能有效除去懸浮顆粒等大分子物質(zhì)，有效減少超濾膜的堵塞和污染。

表3 不同膜過程對應(yīng)的色素透過率Table 3 Pigment permeation rate during different membrane process

納濾膜NF90對色素的透過率只有3%，說明大部分色素保留在截留液中，濾膜的切割分子量越小，對色素的截留效果越好，越適合于色素的濃縮。試驗發(fā)現(xiàn)，納濾膜的透過液最為清澈，幾乎無色素透過，而微濾的透過液顏色最深，故選取微濾0.22 μm的膜進行脫除大分子物質(zhì)，采用納濾膜對色素提取液脫除小分子物質(zhì)，并對色素進行濃縮。

2.3.2 微濾操作壓力對膜通量和透過率的影響 由圖3可知，不同壓力下微濾膜通量均表現(xiàn)出先迅速衰減后趨于穩(wěn)定的趨勢，特別是過濾前5 min內(nèi)，對各壓力而言通量均快速衰減。這是由于壓力作用下，色素提取液中的蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)迅速聚集在膜表面，使膜孔堵塞引起膜通量下降。隨著微濾時間的延長，各壓力下的膜通量均趨于穩(wěn)定。

圖3 不同壓力下微濾膜通量與操作時間的關(guān)系Figure 3 The relationship between operating time and microfiltration membrane flux under different pressure

由圖4可知，膜通量隨操作壓力的增加而顯著增加；色素透過率隨壓力的增大先上升后下降，當(dāng)操作壓力為0.050 MPa時透過率最大。當(dāng)操作壓力高于0.075 MPa時，色素透過率逐漸減小。隨著操作壓力的升高，色素的對流傳質(zhì)增強，透過率增加。隨后操作壓力繼續(xù)增加會導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)及水溶性淀粉等大分子沉積在膜上并堵塞膜孔，使色素的過濾阻力增加從而降低其透過率，抵消了膜面流速剪切力所引起的減弱作用，沉積物在高壓力作用下不斷增厚、變實，出現(xiàn)過濾阻力增加，使色素透過率隨操作壓力的增加而下降。當(dāng)操作壓力為0.050 MPa 時，透過率較高，但綜合膜通量考慮，操作壓力選取0.075 MPa 為宜。

圖4 操作壓力與膜通量和透過率的關(guān)系Figure 4 The relationship between pressure and membrane flux and permeability

2.3.3 納濾操作壓力對膜通量和透過率的影響 由圖5可知，隨著操作壓力的增大，不同納濾膜通量均逐漸增加，3種納濾膜的孔徑大小順序為NF270>NF245>NF90，因此相同壓力下的膜通量也符合此遞減順序。不同納濾膜對應(yīng)的色素透過率隨操作壓力的增大緩慢上升，這是由于操作壓力增大時，膜兩側(cè)的推動力增加，提高了色素的滲透能力。操作壓力過高會加劇膜面濃差極化現(xiàn)象，膜面色素濃度增加使其跨膜擴散作用增強，導(dǎo)致截留率下降。

圖5 操作壓力對納濾膜滲透分離性能的影響Figure 5 The nanofiltration permeation and separation performance influenced by pressure

總體上看，納濾膜對色素分子透過率變化較平緩，而對膜通量的變化較為顯著。NF270雖有較高膜通量，但其對色素透過率也高達10%～20%，而NF245通量則介于NF90和NF270之間，當(dāng)操作壓力為0.3 MPa時，NF245的通量為10.79 L/(m2·h)，色素透過率為8.54%，而相同壓力下NF90的通量僅為5.83 L/(m2·h)，色素透過率為4.17%，綜上，篩選出較優(yōu)的納濾膜為NF245，且確定最佳納濾壓力為0.3 MPa，此時納濾膜通量為 10.79 L/(m2·h)，色素透過率為8.54%。

由圖6可知，膜過濾最初10 min內(nèi)，膜通量均呈緩慢下降趨勢，并在10 min后基本趨于穩(wěn)定。操作壓力越大，膜的穩(wěn)定通量越大，當(dāng)壓力為0.5 MPa時，膜的初始通量約為20 L/(m2·h)，而穩(wěn)定后通量為15 L/(m2·h)，與2.3.2微濾過程相比，納濾過程中的通量衰減緩和。這是由于微濾過程中已處理去除了大部分的多糖、果膠、蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)，使得微濾提取液在納濾階段的膜污染比較輕微，微濾作為有效的預(yù)處理手段，可以保證納濾膜的平穩(wěn)運行。

圖6 納濾膜通量隨操作時間的關(guān)系Figure 6 The permeate flux influenced by pressure during nanofiltration process

2.3.4 微濾—納濾聯(lián)合技術(shù)對紅小豆色素的分離純化

由表4可知，粗提液中花色苷質(zhì)量濃度為307.05 mg/L，與文獻[27]中的花色苷質(zhì)量濃度較接近。經(jīng)微濾處理后花色苷質(zhì)量濃度降為267.62 mg/L，是由于微濾過程中大分子物質(zhì)在膜表面形成了污染層，少量截留了花色苷等小分子物質(zhì)。經(jīng)納濾處理后截留液中花色苷質(zhì)量濃度提高至810.19 mg/L。微濾過程中花色苷透過率達87.16%，總酚、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)透過率分別為35.53%，32.89%，34.83%，即微濾過程花色苷大部分透過而蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)被部分截留；而納濾過程主要去除了糖類、小分子酚類和小分子蛋白等物質(zhì)，由于花色苷是酚類物質(zhì)的一種，因此納濾截留液中花色苷和總酚質(zhì)量濃度均得到了一定程度的提高。此外納濾過程中糖類物質(zhì)的透過率為86.05%，是由于紅小豆種皮提取液中部分單糖、二糖類物質(zhì)與花色苷的分子量(200～400 Da)較接近，盡管NF245的切割分子量為 200 Da左右，但由于納濾膜的分離效果除了與有機物的分子量大小有關(guān)外，還與膜材料的性質(zhì)、有機分子的結(jié)構(gòu)、極性等參數(shù)有關(guān)[28-29]，因此納濾過程中單糖、二糖、酚類等小分子雜質(zhì)只起到了部分脫除作用。劉志強等[30]發(fā)現(xiàn)提取液中含有的一些小分子糖類等物質(zhì)進一步提高了原花色素的純度。

表4 微濾—納濾組合技術(shù)對紅小豆紅色素分離純化效果Table 4 The effect of combined MF-NF technology on the separation and purification of red adzuki bean pigment mg/L

對純化前后紅小豆種皮提取物凍干粉末中花色苷含量和色價進行測定，純化前花色苷含量約為(31.1±0.25) mg/g，色價為24.05±0.02；純化后的紅豆皮花色苷凍干粉末顏色更加鮮艷，花色苷含量為(145.80±0.17) mg/g，色價為58.08±0.09，為純化前的2.41倍。以上研究表明經(jīng)微濾—納濾膜組合分離后，紅小豆提取液中花色苷質(zhì)量濃度大幅提高，對于總酚、蛋白質(zhì)、糖類雜質(zhì)等也起到了一定的去除作用，微濾—納濾聯(lián)合技術(shù)對紅小豆紅色素提取液有較好的純化效果。

3 結(jié)論

以水為浸提劑對紅小豆種皮色素進行提取，并采取三因素三水平正交試驗優(yōu)化其提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，紅小豆種皮色素提取的最優(yōu)工藝條件為料液比(m紅小豆種皮∶V水)1∶30 (g/mL)、浸提時間90 min、浸提溫度90 ℃，此條件下色素提取量為49.05 mL，各因素對色素提取量的影響次序為料液比>浸提時間>浸提溫度。采取微濾(0.22 μm)和納濾(NF245)膜組合工藝對紅小豆種皮色素進行分離純化，其中微濾的最佳操作壓力為0.075 MPa，納濾的最佳操作壓力為0.3 MPa，經(jīng)處理后納濾截留液中花色苷質(zhì)量濃度達810.19 mg/L，總酚、糖和蛋白質(zhì)濃度進一步降低。純化后紅豆皮色素凍干粉中花色苷含量為(145.80±0.17) mg/g，色價為純化前的2.41倍。后續(xù)還需加強色素提取液的前處理以減緩膜污染，同時加強納濾操作參數(shù)的優(yōu)化以提高紅小豆花色苷的純化效果。