江國斌，陳曉萍

（臺州醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，浙江 臺州318050）

乳腺癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，是女性死亡的首要原因[1]。據(jù)全球癌癥報告統(tǒng)計，2016年全球約25萬人確診為乳腺癌，占女性惡性腫瘤新發(fā)病例的29%左右[2]。近年來，乳腺癌在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化，對我國女性生命安全造成嚴重威脅[3]。因此，探究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找新治療靶點具有潛在價值。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）屬于非編碼RNA，長度＞200個核苷酸，與乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。組織分化誘導非蛋白編碼RNA（tissue differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR）屬于非典型lncRNA，是體細胞組織分化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展所需的關(guān)鍵lncRNA[6]。microRNA-544a（miR-544a）在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。F-box/FBXW7是一種經(jīng)典的抑癌基因，介導多種重要癌蛋白的泛素化降解，其基因表達缺失會導致原癌基因激活[8]。目前，lncRNA TINCR對乳腺癌的影響尚缺少研究。本實驗通過研究過表達lncRNA TINCR靶向miR-544a/FBXW7對人乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響，為尋找乳腺癌新治療新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑人乳腺癌MCF7細胞株、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、FBXW7抗體、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）抗體、β-actin抗體（貨號：SCC-111011-1、S9030、90113、BC3640、PT0001、K004271P、K000323P、K001437M、K001435M、M1000170）購自上海恒斐生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668030）購自美國Life Technologies公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）試劑盒（貨號：DEM202-50T）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑、Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒、羊抗兔IgG抗體（貨號：QN1293-OIR、WK304、BTN131149）購自北京百奧萊博科技有限公司，MatrigelTM基質(zhì)膠（貨號：354234）購自廣州威佳科技有限公司，pcDNA3.1空載體、化學發(fā)光試劑盒（貨號：ZY790-20、ZY-11256）購自上海澤葉生物科技有限公司，TINCR、miR-544a、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 主要儀器恒溫培養(yǎng)箱（型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC）購自日本松下公司，全自動酶標儀（型號：ELX800）購自美國BIO-TEK公司，流式細胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ）購自美國BD公司，顯微鏡（型號：CX31）購自日本OLYMPUS公司，化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiDocXRS）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 細胞培養(yǎng)將人乳腺癌MCF7細胞株（上海恒斐生物科技有限公司）放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在含10%胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素各100 u/ml）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞融合至80%左右時，胰酶消化、傳代。

1.2.2 細胞分組取對數(shù)期MCF7細胞，按1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-TINCR表達載體、pcDNA3.1空載體分別轉(zhuǎn)入到MCF7細胞，分別作為TINCR上調(diào)組和TINCR NC組，將未轉(zhuǎn)染的MCF7細胞作為空白對照組。轉(zhuǎn)染24 h后正常培養(yǎng)，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3 qRT-PCR檢測MCF7細胞TINCR、miR-544a相對表達量

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調(diào)組MCF7細胞培養(yǎng)24 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，β-actin為內(nèi)參基因。反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸40 s，共計45個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 CCK-8法檢測MCF7細胞增殖情況

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調(diào)組MCF7細胞培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h。采用全自動酶標儀檢測450 nm處的光密度值（optical density,OD）。

1.5 流式細胞術(shù)檢測MCF7細胞凋亡情況

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調(diào)組MCF7細胞培養(yǎng)48 h，PBS洗滌后使用400 μl 1×結(jié)合緩沖液制備細胞懸浮液，并調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，加入5 μl Annexin V-FITC；15 min后加入10 μl PI孵育1 h，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.6 Transwell法檢測MCF7細胞侵襲情況

使用50 μl Matrigel基質(zhì)膠（1∶8稀釋）鋪Transwell小室的微孔膜，用無血清培養(yǎng)液將空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調(diào)組MCF7細胞稀釋至2.5×105個/ml，在Transwell小室上層加200 μl，下室加500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件下孵育24 h，擦去膜上細胞，用4%多聚甲醛固定已經(jīng)穿膜并黏附在微孔膜外表面的細胞10 min，PBS洗滌，0.5%結(jié)晶紫染色20 min。在200倍鏡的顯微鏡下隨機選取6個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，并計算平均值。

1.7 Western blotting檢測MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調(diào)組MCF7細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，提取各組細胞總蛋白并定量。電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2、β-actin抗體（1∶500）孵育過夜，TBST洗滌，加羊抗兔IgG二抗（1∶1 000，辣根過氧化物酶標記）室溫孵育1 h，發(fā)光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.8 回復實驗

取TINCR上調(diào)組MCF7細胞，按1×105個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-544a NC、miR-544a mimic轉(zhuǎn)入MCF7細胞，其分別作為miR-544a NC組和miR-544a上調(diào)組。轉(zhuǎn)染24 h后正常培養(yǎng)，qRT-PCR檢測miR-544a相對表達量驗證轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測MCF7細胞增殖，Transwell法檢測MCF7細胞侵襲，Western blotting檢測MCF7細胞FBXW7蛋白相對表達量，具體步驟參照1.3、1.4、1.6和1.7。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞lncRNA TINCR相對表達量升高（P＜0.05），miR-544a相對表達量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較（±s）

表2 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調(diào)組比較，P＜0.05。

組別miR-544a lncRNA TINCR空白對照組TINCR NC組TINCR上調(diào)組F值P值1.04±0.25?0.99±0.24?0.52±0.16 10.167 0.002 1.02±0.28?1.05±0.33?1.84±0.42 10.702 0.001

2.2 各組MCF7細胞增殖情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞OD值分別為（0.69±0.18）、（0.78±0.22）和（0.35±0.09），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.414，P=0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞OD值降低（P＜0.05）。

2.3 各組MCF7細胞凋亡情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞凋亡率分別為（11.17±2.04）%、（10.65±1.88）%和（46.82±8.79）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=91.083，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組MCF7細胞流式細胞圖

2.4 各組MCF7細胞侵襲情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞穿膜細胞數(shù)分別為（224.25±28.65）個、（206.76±23.92）個和（146.92±17.55）個，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.402，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞穿膜細胞數(shù)降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞侵襲情況（×100）

2.5 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調(diào)組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞FBXW7、Bax蛋白相對表達量升高（P＜0.05），PCNA、MMP-2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對比表達量比較（±s）

表3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對比表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調(diào)組比較，P＜0.05。

組別MMP-2蛋白PCNA蛋白Bax蛋白FBXW7蛋白空白對照組TINCR NC組TINCR上調(diào)組F值P值0.92±0.25?0.97±0.26?0.29±0.06 19.337 0.000 0.89±0.26?0.84±0.22?0.33±0.08 14.123 0.000 0.47±0.11?0.38±0.10?0.93±0.27 16.491 0.000 0.52±0.12?0.55±0.15?0.86±0.23 7.102 0.007

圖3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白的表達

2.6 lncRNA TINCR通過靶向miR-544a影響MCF7細胞增殖、侵襲及FBXW7蛋白的表達

TINCR上調(diào)組、miR-544a NC組、miR-544a上調(diào)組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數(shù)及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：TINCR上調(diào)組與miR-544a NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與TINCR上調(diào)組和miR-544a NC組比較，miR-544a上調(diào)組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數(shù)及miR-544a相對表達量升高（P＜0.05），F(xiàn)BXW7蛋白相對表達量降低（P＜0.05），見表4和圖4、5。

表4 各組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數(shù)及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數(shù)及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調(diào)組比較，P＜0.05。

組別FBXW7蛋白OD值侵襲細胞數(shù)/個miR-544a TINCR上調(diào)組miR-544a NC組miR-544a上調(diào)組F值P值0.83±0.08?0.79±0.08?0.43±0.07 49.356 0.000 0.34±0.07?0.36±0.07?0.62±0.08 27.111 0.000 160.66±15.27?153.84±15.83?212.93±18.40 22.875 0.000 1.01±0.09?1.02±0.08?1.85±0.10 170.767 0.000

圖4 TINCR上調(diào)組、miR-544a NC組、miR-544a上調(diào)組MCF7細胞侵襲情況（×100）

圖5 各組MCF7細胞FBXW7蛋白的表達

3 討論

乳腺癌在女性腫瘤中排行第1位，具有發(fā)病率高、惡性程度高、易產(chǎn)生耐藥性及預后差等特點[9]。臨床上治療乳腺癌多采用手術(shù)、放射治療，但容易引起并發(fā)癥，影響患者生存質(zhì)量[10]。目前乳腺癌發(fā)病機制尚未統(tǒng)一，臨床上缺少治療該病的有效靶向手段。但近年來，越來越多的研究表明乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與癌細胞增殖、侵襲能力有關(guān)[11]。

lncRNA是一類長度＞200個核苷酸的RNA，不具有開放閱讀框及蛋白質(zhì)編碼功能[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA廣泛參與機體各種生理病理過程，并作為抑癌或致癌基因在癌細胞增殖、遷移過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13-14]。lncRNA TINCR在人類分化成熟的皮膚組織中異常表達，且lncRNA TINCR可作為致癌基因或抑癌基因，參與多種腫瘤的增殖、侵襲等過程。ZHANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TINCR是潛在的致癌基因，上調(diào)其表達對食管鱗狀癌細胞增殖、遷移、侵襲過程具有促進作用。HU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TINCR高表達可促進肝癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。ZHANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TINCR是潛在的抑癌基因，下調(diào)其表達對結(jié)直腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移過程具有促進作用。但TINCR在乳腺癌中發(fā)揮的作用尚不清楚。

LIU等[18]研究表明，lncRNA TINCR是一種相互競爭的內(nèi)源性RNA，可通過miR-544a將其從靶基因FBXW7中分離出來，其在肺癌中發(fā)揮抑制增殖、侵襲的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-544a能促進乳腺癌細胞發(fā)生遷移和侵襲。FBXW7在許多癌癥中發(fā)揮抑癌作用[19]。GAO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子FBXW7可以通過促進MTDH蛋白水解來抑制乳腺癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。而本研究中上調(diào)TINCR表達后，發(fā)現(xiàn)MCF7細胞OD值、穿膜細胞數(shù)降低，凋亡率升高，提示lncRNA TINCR對乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲過程具有抑制作用，且TINCR可誘導MCF7細胞凋亡。為探究TINCR對MCF7細胞的影響是否與miR-544a、FBXW7有關(guān)，本研究進一步檢測miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量。結(jié)果表明，上調(diào)TINCR表達后，MCF7細胞miR-544a相對表達量降低，F(xiàn)BXW7蛋白相對表達量升高，而在上調(diào)TINCR的同時上調(diào)miR-544a表達后，F(xiàn)BXW7蛋白相對表達量降低，同時細胞OD值、侵襲細胞數(shù)升高，提示過表達lncRNA TINCR可能是通過抑制乳腺癌MCF7細胞miR-544a表達，進而促進FBXW7表達，發(fā)揮對乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲的抑制作用，以及對凋亡的促進作用。進一步推測，TINCR影響MCF7細胞的機制與在肺癌類似[18]，可能通過抑制miR-544a與FBXW7結(jié)合，發(fā)揮FBXW7對乳腺癌MCF7細胞的抑制增殖、侵襲及促進細胞凋亡作用。

PCNA、Bax、MMP-2分別為參與細胞增殖、凋亡、侵襲過程的常見蛋白，在乳腺癌細胞中亦發(fā)揮作用[21-23]。本研究結(jié)果表明，與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調(diào)組MCF7細胞PCNA、MMP-2蛋白相對表達量降低，Bax蛋白相對表達量升高，提示過表達lncRNA TINCR可抑制乳腺癌MCF7細胞PCNA、MMP-2表達，并促進Bax表達，從而抑制乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲，誘導凋亡，推測lncRNA TINCR靶向miR-544a/FBXW7抑制乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲及促進凋亡過程可能是通過調(diào)控PCNA、Bax、MMP-2表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，lncRNA TINCR可能通過靶向miR-544a/FBXW7，抑制人乳腺癌細胞的增殖、侵襲，并促進人乳腺癌細胞凋亡。但乳腺癌發(fā)生、發(fā)展途徑復雜，lncRNA TINCR涉及的其他細胞內(nèi)信號通路及其在不同乳腺癌細胞中的作用還需進一步探究，以期更全面地評價lncRNA TINCR對乳腺癌的影響，為臨床治療乳腺癌提供新的思路。