甘薯塊根淀粉酶特性及糖化效應(yīng)研究

項(xiàng) 超 沈升法 吳列洪 李 兵 羅志高

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是中國(guó)重要的糧食作物[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和對(duì)消費(fèi)需求的不斷改變，鮮食的消費(fèi)比例持續(xù)增加，甘薯加工產(chǎn)品呈現(xiàn)多樣化、營(yíng)養(yǎng)化、細(xì)分化以及休閑食品銷量逐步上升等趨勢(shì)，對(duì)優(yōu)質(zhì)鮮食甘薯和加工專用品種的需求日益增長(zhǎng)[2]。甘薯塊根富含淀粉和淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶是促進(jìn)淀粉分解的主要酶[3,4]。其中，α-淀粉酶將淀粉分子的α-1,4糖苷鍵任意切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖，β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4糖苷鍵，生成麥芽糖[4]。淀粉酶的活性是決定淀粉糖化程度主要因素，也是甘薯品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[5]。

甘薯品種的糖化特性存在基因型差異，具體表現(xiàn)在淀粉率、可溶性糖含量、還原糖含量和淀粉酶活性等指標(biāo)的差異[3-9]。史春余等[4]研究表明食用型品種塊根膨大后期，由于淀粉酶的作用導(dǎo)致薯塊總淀粉含量較低、可溶性總糖含量較高。陳顯讓等[6]研究發(fā)現(xiàn)在塊根膨大后期，β-淀粉酶和總淀粉含量多數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)，可以為選擇提取β-淀粉酶的優(yōu)質(zhì)甘薯來源提供參考。陸國(guó)權(quán)等[7]研究表明不同干率類型的甘薯品種間淀粉酶活性存在差異，高干型、低干型與中干型品種淀粉酶活性存在極顯著差異。謝逸萍等[8]報(bào)道了不同基因型品種淀粉率在整個(gè)貯藏期均有所下降, 不同淀粉含量品種的淀粉酶活性存在明顯差異。不同品種間塊根淀粉酶活性的差異可能預(yù)示著其塊根中淀粉水解所需的最低淀粉酶活性是不同的，這與淀粉糊化和相關(guān)淀粉酶活性保持條件有關(guān)[4, 10-14]。Mensah等[12]研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶活性受溫度、基因型、加熱時(shí)間以及基因型與溫度交互作用影響，升溫和延長(zhǎng)加熱時(shí)間通常會(huì)降低β-淀粉酶的活性并導(dǎo)致糖分的變化。

隨著鮮食甘薯消費(fèi)需求和加工原料需求的變化，提前在夏季或高溫季節(jié)陸續(xù)進(jìn)行甘薯收獲，但一般此時(shí)鮮薯糖分結(jié)累少、甜度低，其淀粉酶活性可能還不足以促進(jìn)淀粉的迅速水解[4]。關(guān)于夏季或高溫季節(jié)收獲的甘薯淀粉酶糖化特性及不同類型內(nèi)源淀粉酶活性保持條件的研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定甘薯在蒸煮熟化前后其塊根中可溶性糖、還原糖含量以及不同類型淀粉酶活性變化，開展淀粉酶對(duì)甘薯淀粉的酶解特性研究，并進(jìn)行生淀粉體外糖化的分析，不僅為系統(tǒng)了解加工過程中甘薯淀粉酶特性及糖化效應(yīng)，而且為篩選鮮食或加工專用品種，有效開發(fā)甘薯資源，提高其加工產(chǎn)品質(zhì)量、功能及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試甘薯材料為浙薯13、浙薯75和浙薯33；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL)、硫酸銅、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸,均為分析純；超純水；α-淀粉酶測(cè)定的K-CERA試劑盒、β-淀粉酶測(cè)定的K-BETA3試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

C21-SK2108多功能電磁爐(蒸煮模式，1 100 W)，DKS-24恒溫水浴鍋，DS-1高速組織搗碎機(jī)，Eppendorf Centrifuge 5810R離心機(jī)，752紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 薯塊樣品處理

薯塊于8月15日(夏季)收獲，生育期109 d。選取3個(gè)中等大小(250 g左右)的新鮮薯塊，每個(gè)薯塊為一個(gè)重復(fù)，橫向中間對(duì)切，其中半個(gè)薯塊用電磁爐隔水蒸煮1 h，鮮薯蒸熟后冷卻至室溫，切除切面1 cm左右薯肉，從整個(gè)橫切面均勻刮取1.0 g薯泥樣品，用于熟薯糖分的測(cè)定；另外半個(gè)薯塊從橫切面均勻刮取兩份1.0 g薯泥樣品，分別用于淀粉酶及生薯糖分的測(cè)定。

1.3.2 還原糖和可溶性糖含量的測(cè)定

參照GB/T 5009.7—2016直接滴定，對(duì)生薯和熟薯樣品進(jìn)行還原糖和可溶性糖含量測(cè)定。取已備好的生薯和熟薯樣品各1.0 g，分別加水9 mL，置于60 ℃恒溫水浴中保溫2 h，冷卻后以1 789 g速度離心10 min，各吸取上清液6 mL，每份上清液平均分成兩份，一份用于還原糖含量測(cè)定，另一份加入6 mol/L鹽酸在68 ℃水解后用于可溶性糖含量測(cè)定。

1.3.3 淀粉酶活性的測(cè)定

采用K-CERA和K-BETA3試劑盒分別測(cè)定α-淀粉酶[14,15]和β-淀粉酶活性[14,16]。取1.0 g鮮薯樣品，加入1 mL提取緩沖劑進(jìn)行研磨，再加入4 mL提取緩沖劑分三次對(duì)研磨的鮮薯樣品進(jìn)行沖洗并轉(zhuǎn)移到15 mL塑料離心管中，以447 g速度離心10 min，吸取上清液0.2 mL，然后加入0.2 mL α-淀粉酶測(cè)定反應(yīng)底物，置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min，加3 mL終止液，在400 nm處測(cè)定吸光度值。取0.2 mL上清液，加入3 mL稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋，從中吸取0.2 mL溶液，然后加入0.2 mL β-淀粉酶測(cè)定反應(yīng)底物，置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min，加3 mL終止液，在400 nm處測(cè)定吸光度值。其中待測(cè)酶液和底物，均事先置于40 ℃恒溫水浴中保溫5 min。測(cè)完后按照試劑盒提供的計(jì)算公式及稀釋倍數(shù)，換算成以鮮薯計(jì)算的酶活性單位(U)。

1.3.4 淀粉酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定

參考淀粉酶活性測(cè)定方法，分別測(cè)定樣品在50、60、70、80、90 ℃時(shí)的酶活性，由于品種間及不同溫度下酶活性差距大，需要調(diào)整適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，確保吸光度在量程范圍內(nèi)，再按各自的稀釋倍數(shù)，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換到淀粉酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍數(shù)下的吸光度。其中β-淀粉酶熱穩(wěn)定性測(cè)定增加75 ℃的處理。參考淀粉酶活性測(cè)定方法，在60 、70 、75 、80 ℃條件下測(cè)定20 min內(nèi)每2 min時(shí)的β-淀粉酶活性，以標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍數(shù)下的吸光度來表示。

1.3.5 生淀粉體外糖化的測(cè)定

選取3個(gè)品種的新鮮薯塊，切絲后用高速組織搗碎機(jī)搗碎后，使用清水沖洗，180目篩網(wǎng)過濾2次，所得濾液以447 g速度離心10 min，棄上清液得到淀粉。稱取新鮮濕淀粉0.20 g置于15 mL塑料離心管，加入1.3.3中的上清液0.4 mL和5 mL蒸餾水，置于75 ℃水浴鍋，并控制水浴鍋在15 min左右升到85 ℃，期間不斷振蕩離心管。達(dá)到85 ℃后迅速取出，置入冷水中冷卻。以加入5.4 mL蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖含量，換算成以鮮薯計(jì)的還原糖含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中組間平均值比較采用Duncan分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-淀粉酶活性變化

對(duì)3個(gè)甘薯品種的β-淀粉酶活性進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)的方差分析(表1)，結(jié)果表明，甘薯塊根中β-淀粉酶活性高低受品種、加熱溫度和保溫時(shí)間極顯著的影響，也取決于品種和反應(yīng)條件(包括溫度和時(shí)間)之間的相互作用。其中，加熱溫度占總方差比例最大。

表1 加熱溫度和保溫時(shí)間對(duì)不同甘薯品種塊根中β-淀粉酶活性的影響

當(dāng)加熱溫度高于酶的最適溫度時(shí)，酶的活性就會(huì)逐漸失去；隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，薯塊中淀粉酶的失活率升高，并且這個(gè)過程是不可逆的。因此，適宜的加熱溫度和保溫時(shí)間，在保持甘薯淀粉酶活性的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。溫度對(duì)β-淀粉酶活性的影響由圖1所示，3個(gè)甘薯品種的β-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢(shì)基本一致，變化的程度有所不同。當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，β-淀粉酶活性隨溫度的升高而增大；當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，β-淀粉酶活性隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)。供試品種在60 ℃溫度條件下可以較好地保持甘薯淀粉酶活性，與前人研究結(jié)果基本一致[14,17]。β-淀粉酶不能水解天然淀粉，能水解糊化的甘薯淀粉[14]。本研究中β-淀粉酶在75 ℃和80 ℃仍有較強(qiáng)的活性，80 ℃時(shí)其糖化能力已經(jīng)大大降低，說明其不能耐受80 ℃以上的高溫。在70～90 ℃范圍內(nèi)，浙薯13的β-淀粉酶活性下降幅度顯著小于浙薯33，與浙薯75無顯著差異；說明浙薯13的β-淀粉酶熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)溫度一定時(shí)，在保溫時(shí)間在20 min以內(nèi)時(shí)，β-淀粉酶活性總體上都是隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)而增大；當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，糖化速度隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，β-淀粉酶活性趨于平穩(wěn)(圖2)。另外，對(duì)3個(gè)甘薯品種之間比較分析發(fā)現(xiàn)，浙薯33的淀粉酶活性在同樣反應(yīng)條件下最高，浙薯13次之，浙薯75最低。與保溫時(shí)間和品種兩個(gè)因素相比，溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其產(chǎn)品加工過程中應(yīng)嚴(yán)格控制加熱的溫度。

圖1 不同溫度條件下β-淀粉酶活性變化

圖2 不同溫度及不同加熱時(shí)間處理對(duì)三個(gè)品種甘薯β-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響

3個(gè)甘薯品種中，浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的淀粉酶活性，浙薯13的耐熱性更強(qiáng)。浙薯13和浙薯33因含有相對(duì)較高的β-淀粉水解潛力使其成為薯脯干加工的良好原料。

2.2 α-淀粉酶活性變化

方差分析結(jié)果表明，甘薯塊根中α-淀粉酶活性不僅受品種和加熱溫度極顯著的影響，而且受品種與加熱溫度之間互作效應(yīng)極顯著的影響(表2)。其中，加熱溫度占總方差比例最大。與品種相比，加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。溫度對(duì)α-淀粉酶活性的影響由圖3所示，α-淀粉酶活性隨溫度的升高而下降；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，其糖化能力已經(jīng)大大降低；在50～70 ℃范圍內(nèi)，3個(gè)品種的α-淀粉酶活性均大幅下降，其中浙薯13的α-淀粉酶活性下降幅度最小且顯著低于浙薯75，與浙薯33下降幅度無明顯差異。當(dāng)溫度超過80 ℃時(shí)，酶開始變性失活，從而抑制了糖化反應(yīng)的進(jìn)行。3個(gè)甘薯品種的α-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢(shì)基本一致，變化的程度有所不同。對(duì)圖1和圖3的結(jié)果進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，各品種塊根中α-淀粉酶活性都遠(yuǎn)低于β-淀粉酶活性，這與前人的研究結(jié)果一致。

表2 加熱溫度對(duì)不同甘薯品種塊根中α-淀粉酶活性的影響

圖3 不同溫度條件下α-淀粉酶活性變化

2.3 還原糖、可溶性糖含量變化

β-淀粉酶催化可溶性淀粉向糖的轉(zhuǎn)化，從而增加了游離糖的組成和加工產(chǎn)品的甜度[12]。從圖4可以看出，不同品種在蒸煮之后的可溶性糖和還原糖含量均顯著增加，且還原糖含量的增幅較可溶性糖含量更大。不同品種間熟薯可溶性糖含量和還原糖含量均存在顯著差異；可溶性糖含量和還原糖含量的增量和增幅均是浙薯33最大，浙薯13次之，浙薯75最小。以上結(jié)果可以推斷，甘薯蒸煮過程中，達(dá)到淀粉糊化溫度后，β-淀粉酶仍存在較大活性，對(duì)糊化淀粉的糖化作用導(dǎo)致甘薯蒸煮過程中糖分的變化[5,18-20]。進(jìn)一步的生淀粉體外糖化實(shí)驗(yàn)證明，在75～85 ℃條件下，以還原糖含量為指標(biāo)，含β-淀粉酶的甘薯提取液能使生淀粉在糊化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)糖化。β-淀粉酶活性高的品種，其糖化產(chǎn)率，即還原糖含量也相應(yīng)較高。夏季或高溫季節(jié)進(jìn)行甘薯收獲時(shí)，鮮薯糖分結(jié)累少，甜度低，而β-淀粉酶能在蒸煮過程中大幅度增加糖分，因此選擇β-淀粉酶活性高、熱穩(wěn)定性好的品種，適合夏季收獲，作為鮮食或加工品種應(yīng)用。

注：同一類型的糖分柱上不同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 不同品種蒸煮前后糖分變化

注：不同字母的表示處理間差異顯著(P< 0.05)。圖5 生淀粉體外糖化結(jié)果

在適宜條件下，α-淀粉酶隨機(jī)作用于淀粉鏈內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物是糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖；β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖[4]?；谝陨献饔脵C(jī)理，Mensah等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，α-淀粉酶和β-淀粉酶水解淀粉存在很好的協(xié)同作用。甘薯塊根中含有一定量的α-淀粉酶，在高溫下，它的存在可能增強(qiáng)了淀粉向麥芽糖的轉(zhuǎn)化，而升溫和增加加熱時(shí)間通常會(huì)降低β-淀粉酶的活性并增強(qiáng)麥芽糖的形成[10]。本研究中β-淀粉酶的最佳溫度在60 ℃左右，加熱到75 ℃仍可保留相對(duì)較高比例的內(nèi)源淀粉酶[12,21]。因此，較高溫度下還原糖含量的差異可能是由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的協(xié)同作用。

3 結(jié)論

甘薯塊根中β-淀粉酶活性受品種、加熱溫度和保溫時(shí)間極顯著的影響；與保溫時(shí)間和品種這兩個(gè)因素相比，溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。甘薯塊根中α-淀粉酶活性受品種、加熱溫度以及兩者之間互作效應(yīng)極顯著的影響；與品種相比，加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其產(chǎn)品加工過程中應(yīng)嚴(yán)格控制加熱的溫度。3個(gè)甘薯品種中，浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的β-淀粉酶活性，浙薯13的耐熱性更強(qiáng)。β-淀粉酶活性高的品種，其糖化產(chǎn)率也相對(duì)較高。甘薯品種浙薯13和浙薯33因含有相對(duì)較高的β-淀粉水解潛力和耐熱性，適合在夏季或高溫季節(jié)收獲作為鮮食和加工的良好原料。