溫曉雅，劉 龍，王博龍

(宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)的干燥成熟果實(shí)，主要含有木脂素、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，具有保肝護(hù)肝、鎮(zhèn)靜催眠、抗病毒、抗癌及抗炎等藥理作用[1].五味子甲素(schizandrin A)、五味子乙素(schizandrin B)是五味子木脂素的核心成分，近年來有關(guān)五味子甲素、五味子乙素抗癌的實(shí)驗(yàn)報(bào)道越來越多，如五味子甲素可以抑制人卵巢癌[2]、胰腺癌[3]細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；五味子乙素具有多種機(jī)制的抗癌活性[4]，有利于胃癌[5]、肺癌[6]、膽管癌[7]等癌癥的治療.由此可見，五味子甲素、五味子乙素是極具潛力的抗癌活性成分，全面、系統(tǒng)地揭示它們的作用機(jī)制，對(duì)于五味子抗癌功效的開發(fā)利用具有重要意義.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)依托生物信息學(xué)、高通量組學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科融合，通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，揭示靶點(diǎn)間的協(xié)同作用及生物學(xué)意義，以及模擬成分與靶點(diǎn)的相互作用，在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的中醫(yī)藥復(fù)雜研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8].本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，解析五味子甲素、五味子乙素的抗癌靶點(diǎn)、生物過程、信號(hào)通路等，從生物網(wǎng)絡(luò)角度探討五味子甲素、五味子乙素抗癌的潛在機(jī)制.

1 研究方法

1.1 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫中以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18%為篩選條件檢索五味子甲素、五味子乙素靶蛋白，然后運(yùn)用UniPort(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將上述靶蛋白轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱；在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索五味子甲素、五味子乙素相對(duì)應(yīng)的Canonical SMILES格式，然后導(dǎo)入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetp rediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，以該平臺(tái)藥效團(tuán)模型和基于配體分子相似性搜尋方法查找靶基因；又選取CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫中與五味子甲素、五味子乙素相互作用的前1 000個(gè)靶點(diǎn)，將以上來源靶點(diǎn)合并去重后得到五味子甲素、五味子乙素潛在靶點(diǎn).在GeneCards(https://www.genecar ds.org/)、OpenTargets(https://www.Target-validation.org)數(shù)據(jù)庫中以“cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)合并去重后得到癌癥相關(guān)靶點(diǎn).最后將癌癥靶點(diǎn)與五味子甲素、五味子乙素靶點(diǎn)輸入Venny2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取三者交集作為五味子甲素、五味子乙素抗癌潛在靶點(diǎn).將上述成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，以節(jié)點(diǎn)的連結(jié)度(degree)表示五味子甲素、五味子乙素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，分析五味子甲素、五味子乙素多靶點(diǎn)治療癌癥的藥理機(jī)制.

1.2 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)平臺(tái)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)置medium confidence=0.4，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值，并將結(jié)果保存為TSV格式.將文件信息導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，利用“Network Analysis”功能進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，選取各節(jié)點(diǎn)連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)同時(shí)在平均值之上的靶點(diǎn)作為五味子甲素、五味子乙素抗癌的關(guān)鍵靶點(diǎn).

1.3 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析

將五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)輸入OmicShare(http://omicshare.com/)和DAVID平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO生物過程與KEGG信號(hào)通路分析，然后通過Omicshare 軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化，研究靶點(diǎn)投射的生物過程與KEGG信號(hào)通路和癌癥之間的關(guān)系，明確其治療癌癥的主要藥理機(jī)制.

1.4 分子對(duì)接驗(yàn)證

利用PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)搜索靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，然后應(yīng)用PyMOL軟件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行去水、去磷酸根等處理.同時(shí)利用AutoDuck Tools軟件對(duì)受體進(jìn)行加氫、加電荷等操作，輸出為可識(shí)別的Pdbqt格式.處理后應(yīng)用AutoDuck Vina軟件對(duì)靶蛋白與五味子甲素、五味子乙素進(jìn)行對(duì)接.

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

檢索合并TCMSP、Swiss TargetPrediction及CTD數(shù)據(jù)庫五味子甲素、五味子乙素相關(guān)靶點(diǎn)，得到五味子甲素、五味子乙素靶點(diǎn)1 162個(gè).檢索GeneCards、OpenTargets Platform癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，分別得到癌癥靶點(diǎn)各1 000個(gè).將五味子甲素、五味子乙素靶點(diǎn)和癌癥靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0軟件，去重得到64個(gè)五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)(圖1).將五味子甲素、五味子乙素及64個(gè)抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，得到五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，其中36個(gè)為五味子甲素抗癌靶點(diǎn)，26個(gè)為五味子乙素抗癌靶點(diǎn)，CYP17A1、ATR為五味子甲素、五味子乙素共有作用抗癌靶點(diǎn).

圖1 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)韋恩圖圖2 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

如圖3所示，PPI網(wǎng)絡(luò)中共有64個(gè)節(jié)點(diǎn)，576條連線.圓形節(jié)點(diǎn)的大小表示連接度的大小，圓形節(jié)點(diǎn)越大表示其連接度越大，圓形節(jié)點(diǎn)的周線越粗代表其介度越大.對(duì)連接度、介度及緊密度進(jìn)行分析，篩選得到18個(gè)連接度、介度及緊密度均在平均值之上的靶點(diǎn)作為五味子甲素、五味子乙素抗癌關(guān)鍵靶點(diǎn).其中平均連接度為18，平均介度為1.31×10-2，平均緊密度為5.66×10-1，如表1所示.在18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，主要包括細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白MAPK1、MAPK3、MTOR、JAK2、BRCA1；炎癥因子PTGS2、TLR4；血管生成相關(guān)靶點(diǎn)EGFR、EGF、KDR；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SRC、HSP90AA1；性激素相關(guān)受體AR、ESR1.說明五味子甲素、五味子乙素可能是通過調(diào)節(jié)以上受體、酶、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、炎癥因子等發(fā)揮抗癌作用的.

圖3 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The PPI network of targets

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)Tab.1 The key targets and their topological parameters

2.3 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)的GO富集

運(yùn)用OmicShare云平臺(tái)進(jìn)行GO富集分析，篩選出P<0.001的GO條目51個(gè)，其中生物過程(biology process)25個(gè)、分子功能(molecular function)10個(gè)、細(xì)胞組成(cellular componet)16個(gè).如圖4所示，生物過程主要涉及刺激反應(yīng)、生物過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、生物附著等；分子功能主要涉及催化活性、抗氧化活性、結(jié)構(gòu)分子活性等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞連接等.圖5為GO條目氣泡圖，由圖可見富集因子(rich factor)大的前三條GO條目都是關(guān)于蛋白激酶B信號(hào)及其調(diào)節(jié)的，說明五味子甲素、五味子乙素的抗癌作用與蛋白激酶B密切相關(guān).

圖4 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶點(diǎn)的GO功能分析Fig.4 GO function analysis of schisandrin A and schisandrin B-anticancer targets

2.4 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn)KEGG通路

如表2所示，依據(jù)P<0.05篩選得到與抗癌密切相關(guān)的通路有20條.P取值范圍[0，1]，以顏色表示，越紅表示P越小，說明富集越明顯.圓圈的大小表示該通路下富集的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，圓圈越大表示映射在該通路的基因數(shù)越多.由圖6可見，富集因子最大的通路是膀胱癌和前列腺癌，參與靶點(diǎn)最多的通路是癌癥通路和PI3K-Akt信號(hào)通路.

表2 KEGG信號(hào)通路信息Tab.2 KEGG signal pathway information

2.5 五味子甲素、五味子乙素抗癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

通過PPI網(wǎng)絡(luò)得出的18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，綜合比較，選擇介數(shù)、度值、最短路徑排名第一和第二的EGFR、EGF靶點(diǎn)來進(jìn)行分子對(duì)接.由表3可知，這兩個(gè)靶點(diǎn)與五味子甲素、五味子乙素親和力均小于-20.92 kJ/mol，其中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(圖7)的親和力為-30.96 kJ/mol，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(圖8)的親和力為-27.20 kJ/mol，它們與五味子甲素、五味子乙素對(duì)接的氨基酸殘基如表4所示.

表3 五味子甲素、五味子乙素與靶點(diǎn)的分子對(duì)接Tab.3 Molecular docking of schizandrin A and schizandrin B with targets

圖7 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的分子對(duì)接模型Fig.7 The docking model of epidermal growth factor receptor

圖8 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分子對(duì)接模型Fig.8 The docking model of epidermal growth factor

表4 五味子甲素、五味子乙素作用的氨基酸殘基Tab.4 Amino acid residues of schisandrin A and schizandrin B

3 討論

本研究檢索多個(gè)化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫、疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，挖掘出64個(gè)五味子甲素、五味子乙素抗癌靶點(diǎn).通過靶點(diǎn)的蛋白互作分析，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的MAPK1、MAPK3、MTOR、JAK2、BRCA1；調(diào)控炎癥反應(yīng)的PTGS2、TLR4；參與血管生成的EGFR、EGF、KDR；調(diào)控細(xì)胞遷移的SRC、HSP90AA1；以及性激素受體AR、ESR1，說明五味子甲素、五味子乙素通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控細(xì)胞遷移、抗血管生成、調(diào)控炎癥等途徑發(fā)揮其抗癌機(jī)制.

通過分析最短路徑、介數(shù)和度值3個(gè)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)可知，EGFR及其配體EGF名列一二，是整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)的核心分子.而EGFR屬于酪氨酸激酶家族，是活性肽EGF的跨膜糖蛋白受體，當(dāng)EGF與EGFR胞外特定位點(diǎn)結(jié)合，就會(huì)激活胞內(nèi)的酪氨酸激酶、調(diào)節(jié)蛋白及酶反應(yīng)物質(zhì)，引起細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移以及血管形成等多重生物效應(yīng)，在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用[9].因此，阻斷EGF與EGFR結(jié)合被認(rèn)為是癌癥靶向治療的重要策略之一，為此人們已開發(fā)出了吉非替尼等系列EGFR-酪氨酸激酶抑制劑，以及為隔離EGF作用正在研發(fā)的CIMAvax-EGF疫苗[10].本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR和EGF分別是五味子甲素、五味子乙素的靶點(diǎn)，于是將它們兩兩進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果它們的結(jié)合能均小于-20.92 kJ/mol，屬于高親和力，由此推測(cè)五味子甲素、五味子乙素可能從上下游雙重阻斷EGF/EGFR通路，其中沈伊依等[11]也已證實(shí)五味子甲素能夠靶向EGFR及其下游的SRC，通過減少黏著斑蛋白活化而抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲.

GO富集顯示五味子甲素、五味子乙素靶點(diǎn)重在調(diào)節(jié)蛋白激酶B，蛋白激酶B (PKB) 又稱Akt，已被定義為癌基因，在卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、 胰腺癌和乳腺癌等多種癌組織中均有Akt的過度表達(dá)和活化[12-13]，蛋白激酶B抑制劑哌立福辛則對(duì)人卵巢透明細(xì)胞癌ES2細(xì)胞有明顯的殺傷作用[14].而KEGG分析發(fā)現(xiàn)除癌癥通路外，五味子甲素、五味子乙素靶點(diǎn)參與最多的通路就屬PI3K-Akt通路.PI3K屬于磷脂激酶家族，能被上游的EGF/EGFR激活，活化的PI3K使PIP2磷酸化成PIP3，從而激活其下游的靶激酶Akt.激活的Akt從細(xì)胞膜異位到細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，激活或抑制下游靶蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖、阻止細(xì)胞凋亡，該信號(hào)通路的激活與癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲及血管生成密切相關(guān)[15].綜合上面的核心靶點(diǎn)、GO條目以及KEGG通路分析，可以清晰發(fā)現(xiàn)五味子甲素、五味子乙素主要抗癌機(jī)制在于作用于核心靶點(diǎn)EGFR、EGF，阻斷PI3K-Akt通路激活，抑制Akt活化.王金橋等[16]已實(shí)驗(yàn)證實(shí)五味子乙素通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化，抑制大腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其腫瘤細(xì)胞凋亡.戴國梁等[17]結(jié)腸癌患者腸道內(nèi)VEGF/PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，五味子乙素通過抑制VEGF/PI3K/Akt信號(hào)通路抑制SW620細(xì)胞的活性和遷移.

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)了五味子甲素、五味子乙素的抗癌靶點(diǎn)、生物過程及信號(hào)通路等，發(fā)現(xiàn)了其關(guān)鍵抗癌信號(hào)通路軸EGF-EGFR-PI3K-Akt，為進(jìn)一步深入研究五味子甲素、五味子乙素的抗癌機(jī)制提供了參考依據(jù).