吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，季志紅，艾尼瓦爾·吾買爾，紫若·塔里哈提，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，周文婷*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院；3新奇康藥業(yè)股份有限公司，烏魯木齊 830011

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease in 2019，COVID-19)一種包膜RNA病毒引起的急性肺部感染。新型冠狀病毒(原名2019-nCoV，現(xiàn)名SARS-CoV-2)主要侵犯呼吸系統(tǒng)，主要表現(xiàn)發(fā)熱、干咳、乏力，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征(SARI)，膿毒癥休克，甚至多器官衰竭等[1]。它與一組SARS樣冠狀病毒在致病機制和臨床表現(xiàn)等方面也有較大的相似性[2]。SARS-CoV-2可與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結(jié)合進入細胞造成感染。SARS-CoV-2進入宿主細胞后，釋放RNA與細胞中核糖體集合，翻譯出小核糖核酸病毒的3C蛋白酶(3CLpro)[3,4]。因此3CLpro與ACE2在SARS-CoV-2的致病過程中同樣起到關(guān)鍵作用。然而至今仍缺乏有效抑制該病毒的臨床藥物。

根據(jù)2月1日新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委公布的《新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)(維吾爾醫(yī))治療專家共識》推薦[5]，不少新疆地產(chǎn)藥榜上有名。如屬于濕熱的血液質(zhì)腐濁型患者，推薦酌情使用祖卡木顆粒(Zukamu granule，ZKMG)。ZKMG由山奈、睡蓮花、薄荷、大棗、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黃和罌粟殼等10味中藥組成，具有較好的抗流感病毒、抗菌作用和抗炎作用[6]。

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(integrative pharmacology-based research platform of traditional chinese medicine，TCMIP)V2.0以中醫(yī)藥百科全書在線數(shù)據(jù)庫(ETCM)為數(shù)據(jù)資源，包含疾病相關(guān)分子集及其功能挖掘、證候相關(guān)分子挖掘及功能分析、中藥藥性相關(guān)分子挖掘及功能分析、中藥(含方劑)靶標(biāo)預(yù)測及功能分析、組方用藥規(guī)律分析、中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘、反向查找中藥(含方劑)等七大功能模塊[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以系統(tǒng)生物學(xué)，計算機生物學(xué)以及多向藥理學(xué)為融合的新興學(xué)科?？梢詮亩鄬用婢W(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的角度探究藥物與疾病之間相互作用機理。本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，通過綜合分析祖卡木顆粒的活性成分，并通過分子對接技術(shù)對ZKMG的活性成分與3CLpro和ACE2進行分子對接，探討ZKMG對COVID-19作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為其臨床應(yīng)用提供一定的參考和依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫及方法

1.1 ZKMG化學(xué)成分來源

基于TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)的中藥數(shù)據(jù)庫，收集山奈、睡蓮花、薄荷、大棗、洋甘菊、破布木果、甘草、蜀葵子、大黃和罌粟殼等中藥所含化學(xué)成分，并結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)的“herb”中輸入ZKMG的10味中藥，并獲取化學(xué)成分。

1.2 候選成分的篩選

運用TCMIP V2.0的中藥成分數(shù)據(jù)庫，以“1.1”所得到的成分英文名為限定詞進行檢索，獲取其吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADMET)水平，數(shù)值含義0表示“good”,1表示“moderate”，2表示“l(fā)ow”，3表示“very low”。并結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫的中藥動學(xué)參數(shù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)對ZKMG的10中藥的化學(xué)成分進行篩選[8]。

1.3 ZKMG候選成分配體的前處理

借助ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)下載“1.2”所得的候選成分3D結(jié)構(gòu)的mol格式文件。在PyMol軟件(https://pymol.org/)中檢查空間結(jié)構(gòu)無誤后，以pdb格式保存。將結(jié)構(gòu)件載入AutoDock Tools 1.5.6程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉(zhuǎn)。保存為pdbqt格式，作為對接配體。

1.4 3CLpro和ACE2受體的前處理

采用AutoTools對3CLpro(PDBID：6LU7)和ACE2(PDBID：1R42)晶體結(jié)構(gòu)蛋白進行預(yù)處理，刪除多余的蛋白鏈和配體、加氫去除水分子，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件，作為用于做分子對接的受體。

1.5 分子對接

以“1.3和1.4”項下得到的配體和受體使用Autodock Vina(版本：1.2，http://vina.scripps.edu/index.html)進行對接。最后取優(yōu)勢構(gòu)象進行分析，并用Schrodinger(https://www.schrodinger.com)作圖。

1.6 ZKMG活性成分及其核心靶標(biāo)的篩選

以“1.5”項下得到的與3CLpro和ACE2具有較高結(jié)合能的成分作為活性成分。通過TCMIP V2.0中藥成分數(shù)據(jù)庫以活性成分英文名為關(guān)鍵詞檢索其靶標(biāo)。按照MACCS(molecular ACCess system)分子指紋特征提取方法和Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，針對中藥化學(xué)成分和FDA上市藥物進行相似性打分，打分分數(shù)score≥0.8則為相似性藥物，并進行核心靶標(biāo)的提取。

1.7 基因富集分析

為了系統(tǒng)闡明ZKMG治療COVID-19的作用，“1.6”項下得到的核心靶標(biāo)進行GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析。并通過Cytoscape 3.7.1軟件(版本：3.7.1，https://cytoscape.org)構(gòu)建中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 ZKMG化學(xué)成分收集及候選成分的篩選

ZKMG的10味中藥通過TCMIP V2.0的中藥數(shù)據(jù)庫只檢索到薄荷的28個、甘草的133個、罌粟殼的14個、大黃的88個、大棗的64個化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到薄荷的164個、大棗的133個、甘草的280個、大黃的92個和罌粟殼的24個。在TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到山奈的24個、薄荷的74個、大棗的153個、甘草的172個、大黃的101個和罌粟殼的32個成分。在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到薄荷的26個、大黃的58個、甘草的172個、大棗的49個、罌粟殼的27個和山奈的13個。ZKMG的10味中藥中破布木果、蜀葵子、睡蓮花和洋甘菊等中藥在4大數(shù)據(jù)庫中未被檢索到。為了避免個別認可度較高的有效成分未篩選出來，故同時查閱中國藥典(2015版)和CNKI文獻的相關(guān)成分，得到此類成分并合并至4大數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果中。其中破布木果16個、蜀葵子8個、睡蓮花6個和洋甘菊18個化學(xué)成分[9-13]。以上化學(xué)成分按照TCMIP V2.0數(shù)據(jù)庫的ADMET吸收水平等于0和1，以及TCMSP數(shù)據(jù)庫的OB≥30%和DL≥0.18篩選標(biāo)準(zhǔn)，并刪除重復(fù)的成分后得到48個候選成分(見表1)。

表1 ZKMG通過ADMET篩選的候選成分Table 1 Candidate compounds from ZKMG screened by ADMET

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 分子對接分析結(jié)果

將48個候選成分在通過ZINC數(shù)據(jù)庫以mol格式保存、在PyMol軟件以pdb格式保存、在AutoDock Tools 1.5.6程序以為pdbqt格式保存。以ZKMG的48個候選成分作為配體，以3CLpro和ACE2蛋白為受體，根據(jù)蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)以及蛋白活性口袋進行設(shè)置，配體設(shè)置為柔性，受體剛性(圖1)。按照結(jié)合能來判斷候選成分與靶點的匹配度，一般認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大[14]。為了提高篩選標(biāo)準(zhǔn)，將48個候選成分的最優(yōu)結(jié)合能與目前臨床推薦化學(xué)藥物，即洛匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)和瑞德西韋(remdesivir)等藥物進行對比。結(jié)果表明，瑞德西韋最優(yōu)結(jié)合能在3個臨床推薦化學(xué)藥物中最低，為-4.9 kJ/mol，于是收集最優(yōu)結(jié)合能小于該藥物的活性成分得到16個候選成分，部分結(jié)果見表2。結(jié)果可以看出來，活性成分與2019-nCoV-Mpro結(jié)合模式中可以看出來，氫鍵和π-π相互作用對小分子與蛋白的識別和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。

圖1 2019-nCoV-Mpro與原配體的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Three dimensional structure of 2019-nCoV-Mpro and original ligand

表2 ZKMG候選成分與作用于COVID-19靶點的分子對接Table 2 Molecular docking between ZKMG candidate components and COVID-19 targets (binding energy≤-4.9 kJ/mol)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.3 核心靶標(biāo)的篩選

以上得到的16個活性成分通過TCMIP V2.0中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫以score≥0.8為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。其中g(shù)ancaonin B、licoisoflavone B、glycyrol、lupiwighteone、glyzaglabrin、medicarpin等6個活性成分沒有預(yù)測打分分數(shù)score≥0.8的核心靶標(biāo)。其他10個活性成分有465個核心靶標(biāo)，去重復(fù)得到91個核心靶標(biāo)。

2.4 基因富集分析結(jié)果

利用R語言(cluster profile包)對篩選的91個核心靶標(biāo)進行GO富集分析及KEGG信號通路富集分析。其中GO富集分析中共得到BP為133個，CC為31種，MF為62種。根據(jù)校正后P值進行排序，選擇前各10個基因進行圖形顯示，見圖2。KEGG通路富集分析篩選得到53條信號通路，根據(jù)校正后P值進行排序，選擇前15個基因進行圖形展示(見圖3)。

圖2 ZKMG治療COVID-19核心靶標(biāo)的GO基因功能富集分析Fig.2 Functional enrichment analysis of GO gene in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

圖3 ZKMG治療COVID-19核心靶標(biāo)的KEGG信號通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of hub target in the treatment of COVID-19 with active components of ZKMG

2.5 中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路多維網(wǎng)絡(luò)分析

為了系統(tǒng)的闡明ZKMG對COVID-19的作用，構(gòu)建中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路多維網(wǎng)絡(luò)，見圖4。ZKMG的10味中藥中罌粟殼不包含10個活性成分。其余9味中藥中來自于甘草的5個活性成分、來自于洋甘菊和薄荷的各3個活性成分、來自于山奈，蜀葵子和睡蓮花的各2個活性成分以及自于大黃和大棗的各1個活性成分。中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路多維網(wǎng)絡(luò)包括9味中藥、10個活性成分、91個核心靶標(biāo)以及15個關(guān)鍵通路?；钚猿煞滞ㄟ^聯(lián)合調(diào)控細胞色素P450超家族(CYP1A2、CYP19A1、CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP3A5、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6)參與藥物代謝-細胞色素P450(drug metabolism-cytochrome P450)和細胞色素P450對外源物質(zhì)代謝的影響(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)，γ-氨基丁酸受體家族(GABRA2、GABRG1、GABRA3、GABRA1、GABRG2、GABRA4、GABRA6、GABRA5、GABRG3)參與γ-氨基丁酸能突觸(GABAergic synapse)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)以及PIK3CG、AKT1和CDK6同時參加非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)和小細胞肺癌(small cell lung cancer)。

圖4 ZKMG治療COVID-19的“中藥-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.4 The multidimensional network relationship of “TCM-chemical compound-hub target-key pathway” of ZKMG for treatment COVID-19

3 討論

TCMIP V2.0是有利于克服中藥現(xiàn)代研究中“化學(xué)成分體內(nèi)過程-藥理活性-病征效應(yīng)”之間“碎片化”現(xiàn)象，形成中藥特色的藥理學(xué)評價體系和研究方法。本文通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合發(fā)現(xiàn)，ZKMG的16個活性成分與2019-nCoV-Mpro和ACE2最優(yōu)結(jié)合能小于符合臨床推薦化學(xué)藥物。按照MACCS分子指紋特征提取方法和Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，16個活性成分與FDA上市藥物進行相似性打分，結(jié)果表明，其中木犀草素、毛綱草酚、大黃酸、芒丙花素、山奈甲黃素、半甘草異黃酮B、異鼠李素、洋芫荽黃素、山奈酚和槲皮素等10個活性成分滿足score≥0.8的要求。其中木犀草素(luteolin)通過其抗炎和抗氧化活性抑制膿毒癥誘導(dǎo)的膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[15]。大黃酸(rhein)通過改善肺部微血管屏障，從而有效改善油酸所致急性肺損傷大鼠肺部炎癥及水腫[16]。芒柄花黃素(formononetin)誘導(dǎo)肺癌細胞A549凋亡，抑制其生長[17]。Kaempferide通過降低Akt和claudin-2表達，增強人肺腺癌A549細胞的化療敏感性[18]。香葉木素(diosmetin)通過降低動脈氧合指數(shù)及炎性因子表達水平,對胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷具有一定的治療作用[19]。感染SARS-CoV-2病毒的患者有大量的INF-γ、MCP-1、IP-10和IL-Iβ[21]。SARS-CoV-2病毒感染導(dǎo)致了抑制炎癥的IL-4和IL-10的分泌增加[22]。槲皮素(quercetin)會下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF以及上調(diào)IL-10而發(fā)揮抗炎作用[22]。而山柰酚(kaempferol)通過減輕氧化應(yīng)激以及顯著降低支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子，抑制NF-κB信號通路，從而對病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠產(chǎn)生保護作用[23]。以上都是對新疆祖卡木顆?；钚猿煞址乐蜟OVID-19的預(yù)測結(jié)果提供佐證。其中圣草酚(eriodictyol)、半甘草異黃酮B(semilicoisoflavone B)和異鼠李素(isorhamnetin)等成分的研究報道較少，需要進一步研究。

中藥-活性成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路多維網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，ZKMG中存在一個活性成分與多個核心靶標(biāo)作用，同時也存在不同活性成分用于同一個核心靶標(biāo)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶標(biāo)之間共同作用的機制。KEGG通路分析得出，PIK3CG、AKT1和CDK6等核心靶標(biāo)同時參加神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌和免疫應(yīng)答相關(guān)的信號通路以及肺部最為相關(guān)的小細胞肺癌和非小細胞肺癌。

綜上所述，木犀草素、毛綱草酚、大黃酸、芒丙花素、山奈甲黃素、半甘草異黃酮B、異鼠李素、洋芫荽黃素、山奈酚和槲皮素等10個活性成分可能通過與3C類似蛋白酶結(jié)合作用于多靶點、多通路的協(xié)同作用來發(fā)揮療效的，從而起到輔助治療COVID-19 的作用。鑒于整合藥理學(xué)和分子對接的局限性，需要開展實驗研究，為ZKMG治療COVID-19以及后期的藥物開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。