雷柯煜 鄧治 吳文冠 程漢

(1海南大學(xué)園藝學(xué)院海南海口570228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所海南?？?71101)

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）級聯(lián)途徑由絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶組成，能被各種細(xì)胞外刺激激活［1］，通過磷酸化逐級活化將脅迫信號級聯(lián)放大，傳遞至下游的靶蛋白，從而引起一系列生理生化反應(yīng)。真核細(xì)胞都可以表達MAPK，其通路是由一種保守的三級激酶模式組成，即MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK［2］，通過蛋白質(zhì)磷酸化作用將上游信號級聯(lián)放大傳遞至下游應(yīng)答分子，從而激活抗逆基因的表達，使植物對逆境有一定的適應(yīng)能力。MAPKKK是MAPK級聯(lián)途徑之中的組成部分，在植物生長發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)過程中起著重要的作用［3-4］。

前期通過轉(zhuǎn)錄組分析方法比較了橡膠樹抗寒品種93-114和低溫敏感材料熱墾501間的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)一個MAPKKK基因在橡膠樹抗寒品種中表達水平很高，而低溫敏感材料中幾乎不表達，推測MAPKKK可能在橡膠樹抗寒能力形成中具有重要作用［5-8］。通過同源比對發(fā)現(xiàn)，該橡膠樹MAPKKK和擬南芥MAPKKK16高度同源，且擬南芥MAPKKK16功能并未被鑒定，限制了該基因進一步研究。橡膠樹作為研究對象培育時間長、操作復(fù)雜，且橡膠樹轉(zhuǎn)基因體系不夠成熟［9］，為了深入理解橡膠樹MAPKKK基因功能，尋找行之有效的研究方法，利用模式植物同源基因分析鑒定來研究橡膠樹MAPKKK基因。前期對擬南芥MAPKKK16的功能進行了初步分析，發(fā)現(xiàn)其能夠調(diào)控植物的抗寒能力（未發(fā)表資料）。在此基礎(chǔ)上，將擬南芥MAPKKK16基因完整編碼區(qū)插入酵母雙雜交誘餌載體，成功構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-MAPKKK16，將重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，檢測誘餌蛋白的毒性和自激活活性，為后續(xù)篩選AtMAPKKK16互作蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所需T4連接酶、Sma I限制性內(nèi)切酶來自于NEB公司，高保真酶Prime STAR、缺陷型培養(yǎng)基、X-α-gal購自Takara公司，酵母細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化試劑盒為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。引物合成及測序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。擬南芥植株、pGBKT7載體、酵母菌株Y2HGold及Y2HGold［pGBKT7-53］+Y187［pGADT7-T］（正 對 照）和Y2HGold［pGBKT7-Lam］+Y187［pGADT7-T］（負(fù)對照）均來自于實驗室內(nèi)保存提供，大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自于全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥基因組DNA提取

參照陳相等方法［10］快速提取擬南芥基因組DNA。

1.2.2 擬南芥MAPKKK16基因的擴增和誘餌載體pGBKT7-MAPKKK16的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)AtMAPKKK16基因序列并結(jié)合多克隆位點及酵母表達載體閱讀框，通過軟件BLAST分析設(shè)計引物，上游引物16F序列為5’-GATGGAGATTAATTGGACAAG-3’，下游引物16R序列為3’-GACTTGGTTAGTGAATTTAAC-5’，以擬南芥基因組DNA為擴增模板。

使用限制性內(nèi)切酶Sma I將通過試劑盒回收的目的片段和pGBKT7進行酶切的同時，加入T4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進行PCR擴增，上游引物BDF序列為5’-CATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCT-3’，和下游引物16R序列為3’-GACTTGGTTAGTGAATTTAAC-5’，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將陽性單克隆菌落送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序驗證。

1.2.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

使用上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司的GENMED小量酵母細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化試劑盒制備酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化：將冷凍保存的Y2HGold劃線至YPDA平板上，28～30℃培養(yǎng)48～72 h，挑取單克隆菌落至10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，放入搖床，250 r/min搖菌48 h，分光光度計檢測菌液OD600值在1～2。根據(jù)試劑盒中的說明書操作，得到的感受態(tài)在4℃保存?zhèn)溆茫?1-12］。

將測序結(jié)果正確的陽性單克隆菌落接種至含100μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中（10 mL），在37℃200 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16和陰性對照質(zhì)粒pGBKT7各取3μg分別加入2管制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，按照試劑盒中的說明書進行操作，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻鋪板在SD/-Trp瓊脂平板上，30℃恒溫培養(yǎng)2～5 d，直至菌落長出。

1.2.4 誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16的毒性檢測

在SD/-Trp平板上分別挑取誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16和陰性對照質(zhì)粒pGBKT7轉(zhuǎn)化后的酵母單菌落，進行菌落PCR檢測，鑒定轉(zhuǎn)化是否成功。將陽性單克隆菌落分別置于20 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，在30℃25 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)2～3 d。取100μL的菌液，并以未接種的SD/-Trp液體培養(yǎng)基為空白對照，使用分光光度計測得菌液的OD600值，鑒定誘餌蛋白對酵母細(xì)胞是否有毒性［13-15］。

1.2.5 誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16自激活效應(yīng)檢測

將轉(zhuǎn)化的新鮮誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16與空載體pGBKT7酵母菌液均勻涂布在SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp/x-α-gal平板上，并將Y2HGold［pGBKT7-53］+Y187［pGADT7-T］和Y2HGold［pGBKT7-Lam］+Y187［pGADT7-T］分 別作為正負(fù)對照，30℃培養(yǎng)2～3 d后觀察酵母生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥MAPKKK16基因序列的分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中以橡膠樹MAPKKK序列為查詢序列進行blast比對，發(fā)現(xiàn)擬南芥MAPKKK16基因（At4g26890）與之同源。將AtMAPKKK16序列輸入NCBI的ORF Finder程序，發(fā)現(xiàn)長度為1 335 bp的ORF，推測該序列編碼444個氨基酸。（圖1）通過比對，發(fā)現(xiàn)無內(nèi)含子。

圖1 AtMAPKKK16核苷酸序列及其氨基酸序列

2.2 擬南芥MAPKKK16基因序列的克隆及誘餌載體pGBKT7-MAPKKK16的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

以擬南芥基因組DNA為模板，在50μL的反應(yīng)體系中進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到擴增目的片段與預(yù)期1 335 bp大小一致，并且沒有非特異性擴增（圖2）。通過電泳凝膠回收純化試劑盒回收目標(biāo)條帶。

圖2 擬南芥MAPKKK16基因PCR擴增1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

經(jīng)過Sam I和T4連接酶同時酶切和連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α的后，在含有卡納青霉素抗性的LB平板上挑取多個單克隆菌落，進行菌落PCR鑒定，通過電泳檢測，目的片段大小為700 bp左右，與預(yù)期大小一致（圖3）。將陽性單克隆菌落送去上海生工公司測序鑒定，測序結(jié)果經(jīng)軟件DNAMAN分析，證實插入序列與擬南芥MAPKKK16序列完全一致且方向正確，表明誘餌載體pGBKT7-MAPKKK16構(gòu)建成功。

2.3 誘餌載體的轉(zhuǎn)化及毒性檢測結(jié)果

將pGBKT7-MAPKKK16質(zhì)粒和pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)后，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp平板上，結(jié)果誘餌載體和空載體對照在SD/-Trp平板上長出菌落，在SD/-Leu/-Trp平板上沒有長出菌落（圖4）。挑取SD/-Trp平板上的單菌落做菌落PCR鑒定，證明誘餌載體和空載體已成功轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold中，將陽性單克隆菌落放入SD/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，在分光光度計中檢測，含有誘餌載體的菌液OD600值為1.228，含有空載對照菌液OD600值為1.067，OD600均大于0.8，說明表達蛋白對酵母菌無毒性。

圖3 重組質(zhì)粒pGBKT7-MAPKKK16菌落PCR的鑒定結(jié)果

2.4 誘餌載體自激活檢測結(jié)果

設(shè)置正、負(fù)、空載體3個對照并和誘餌載體同時在SD/-Trp/x-α-gal平板上點板，每個樣品吸取5μL菌液點在平板上，30℃過夜培養(yǎng)。結(jié)果顯示正、負(fù)對照、空載體和誘餌載體均能在SD/-Trp/x-α-gal平板上正常生長，但正對照變藍(lán)色菌落，負(fù)對照、空載對照和誘餌載體為白色菌落（圖5），表明誘餌載體沒有自激活活性。

圖4 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母結(jié)果

圖5 誘餌載體在SD/-Trp/x-α-gal平板上自激活檢測結(jié)果

3 討論

天然橡膠是國家的戰(zhàn)略物資，在國防、航天等高端設(shè)備以及日常生活中廣泛應(yīng)用。我國種植的橡膠樹原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，在我國種植區(qū)培育會面臨低溫、干旱、生物脅迫等問題，因此研究抗寒、抗旱、抗病蟲害且高產(chǎn)的品種更為迫切［16-19］。前期發(fā)現(xiàn)橡膠樹MAPKKK基因與橡膠樹抗寒相關(guān)，但目前橡膠樹轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)尚不成熟，對橡膠樹轉(zhuǎn)基因的直接研究存在著耗時長、材料獲取復(fù)雜等問題，因此為研究橡膠樹抗寒基因MAPKKK，尋找模式植物中的同源基因。在擬南芥中找到與橡膠樹MAPKKK高度同源基因MAPKKK16，對擬南芥MAPKKK16進行互作研究，為橡膠樹相關(guān)的抗逆研究奠定基礎(chǔ)。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）包括三級信號傳遞過程，即MAPK，MAPK激酶及MAPK激酶激酶，通過依次磷酸化將上游信號傳遞至下游應(yīng)答分子，在基因表達調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮著重要作用。目前關(guān)于擬南芥MAPK的研究很多，MAPKKs和MAPKs之間相互作用的研究也有不少的報道，但是沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于擬南芥MAPKKK16的研究和報道。于是實驗室前期對擬南芥MAPKKK16基因的功能進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥抗寒有關(guān)。為篩選MAPKKK16基因互作蛋白，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建了MAPKKK16誘餌載體，并對其自激活活性和毒性進行檢測。

酵母雙雜交技術(shù)是利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白與蛋白之間的相互作用，被廣泛用于多種領(lǐng)域，具有敏感性高、操作便捷等優(yōu)點，已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要實驗手段之一。但同時酵母雙雜交系統(tǒng)存在局限性，經(jīng)常遇到的問題就是假陽性高，產(chǎn)生假陽性的原因有很多，例如某些蛋白本身具有激活或轉(zhuǎn)錄功能，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白（BD-bait）在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可以激活轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。實驗常通過檢測誘餌蛋白能否單獨激活報告基因，以降低假陽性產(chǎn)生的誤差。

本實驗成功構(gòu)建了擬南芥pGBKT7-MAPKKK16誘餌載體，并證明該誘餌載體對酵母無毒性和無自激活作用，可進行后續(xù)的互作研究，可為擬南芥MAPKKK16互作蛋白篩選奠定基礎(chǔ)。在找到并且鑒定擬南芥MAPKKK16的互作蛋白后，對橡膠樹MAPKKK基因的互作研究提供科學(xué)依據(jù)。