任雪石凱欣張震徐陽潘思軼

華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070

《中國藥典》2015年版中記載，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”，因廣陳皮獨特的藥用價值，區(qū)別于其他陳皮。多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones，PMFs)是柑橘屬所特有的一類黃酮類化合物[1]，主要分布在果皮油胞層部位，具有消炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基等生理活性[2]，對內(nèi)分泌系統(tǒng)、心肺也具有一定的保健作用[3]。Li等[4]研究表明大鼠巨噬細胞中的IL-α、IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達可以被PMFs抑制，川陳皮素可調(diào)節(jié)COX-2的活性，抑制PGE2的合成，最后達到抑制關節(jié)軟骨降解、風濕性關節(jié)炎等炎癥的效果。研究最廣泛的PMFs單體是川陳皮素(nobiletin，NOB)和桔皮素(tangeretin，TAN)，其在柑橘中含量更豐富，并且均表現(xiàn)出良好的藥理活性。Parkar等[5]建立糖尿病大鼠模型，研究川陳皮素對心血管的保護效應，發(fā)現(xiàn)川陳皮素可通過抑制氧化應激及炎癥信號通路的表達，使大鼠的心血管功能得到改善。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是肺部炎癥疾病的典型代表之一，目前臨床上多采用機械通氣和化學藥物進行緩解，尚無特效的治療方法[6]，長期使用藥物可能會再次誘發(fā)肺部炎癥并加重ALI。引起ALI的原因很多，其中脂多糖是試驗中最常采用的誘導因素之一。脂多糖(lipopolisaccharide，LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，進入機體后與細胞表面的Toll-樣受體4結合，經(jīng)MyD88依賴的信號通路的活化及細胞信號的傳導，最終激活以NF-κB為主的核內(nèi)因子，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應[7]，形成復雜的系統(tǒng)炎癥效應，最終導致肺組織和細胞的損傷。PMFs的生物活性已有相關研究報道，但PMFs提取物對LPS誘導的ALI的保護作用知之甚少。因此，本研究通過LPS構建小鼠急性肺損傷模型，分析PMFs提取物對急性肺損傷小鼠的抗氧化和抗炎效果，并探討PMFs提取物中對小鼠急性肺損傷起到保護作用的關鍵功能因子，為PMFs功能性成分的開發(fā)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

4周齡SPF級雄性昆明種小鼠84只，體質(zhì)量20～22 g，購于華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0019。

廣陳皮(15年茶枝柑干燥果皮)，產(chǎn)自廣東省江門市新會區(qū)；MPO、GSH-PX、MDA檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β細胞因子ELISA試劑盒，購于北京博奧森生物技術有限公司；其他試劑為分析純和色譜純。

1.2 儀器與設備

全數(shù)字化超導核磁共振譜儀，布魯克公司；離子淌度飛行時間質(zhì)譜儀，美國Waters公司；e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；HTX多功能酶標儀，基因有限公司；超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗方法

1)廣陳皮中PMFs的提取。將廣陳皮粉碎，過2遍孔徑0.25 mm篩。稱取20 g廣陳皮粉，料液比1∶20(g/mL)，提取溶劑為90%乙醇，震蕩混合均勻置搖床中于45 ℃震蕩30 min，之后超聲提取30 min(100 W，45 ℃)。將粗提液抽濾3次至澄清透明，濾渣重新加入90%乙醇重復上述操作。合并2次乙醇提取液，45 ℃真空旋蒸，加入蒸餾水分散攪勻，冷凍干燥，獲得PMFs粗提物，儲存于-20 ℃冰箱中備用。

2)PMFs的純化。稱取PMFs粗提物溶于40%乙醇，上樣體積250 mL，上樣流速0.8 L/h，吸附后，用43%乙醇洗脫柱子，洗脫速度1.2 L/h，洗脫體積2.4 L，再用90%乙醇解吸，解吸速度1.2 L/h，解吸體積2 L，獲得富含目標物質(zhì)的純化液，45 ℃真空旋蒸，冷凍干燥，獲得PMFs提取物，儲存于-20 ℃冰箱中備用。

3)川陳皮素和桔皮素的制備及結構鑒定。高速逆流色譜采用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶0.8∶1∶1，V/V)的溶劑體系，將4種溶液按比例加入分液漏斗，混勻后靜置分層，上下相分別為固定相和流動相，兩相分別超聲脫氣30 min備用。另稱取360 mg PMFs粗提物，溶于18 mL下相，4 000 r/min離心得20 mg/mL樣液。以30 mL/min將上相泵入分離管中，800 r/min，順時針旋轉，之后以3 mL/min注入下相，兩相平衡后由進樣閥注入18 mL樣液，通過紫外檢測器于330 nm檢測流出物，按照色譜峰接收目標餾分，分離溫度25 ℃，再45 ℃真空旋蒸，冷凍干燥，獲得目標物單體，之后通過質(zhì)譜儀和核磁共振譜儀對其結構進行鑒定。

UPLC-MS條件：ACQUITY UPLC-BEH C18(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)色譜柱，流動相：乙腈-水(0.1%甲酸)，洗脫梯度：0～6 min，25%～50%乙腈；6～14 min，50%～60%乙腈，流速0.21 mL/min，進樣量1 μL，ESI離子源，正離子模式，離子源溫度135 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速600 L/h，毛細管電壓3.00 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，單次掃描時間為1 s。

1H NMR條件：5 mm 核磁管，頻率600 MHz，溶劑CDCl3(1%TMS)，控溫精度±0.1 ℃，磁場強度14.1 T，分辨率R≤0.60 Hz，靈敏度S/N≥900∶1，掃描2次。

4)川陳皮素和桔皮素的純度鑒定。高效液相色譜條件：Agilent C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相：乙腈-水(0.4%甲酸)，洗脫梯度：0～15 min，25%～50%乙腈；15～35 min，50%～60%乙腈；流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長330 nm，進樣量10 μL。

5)動物飼養(yǎng)、造模及分組。在Ye等[8]的研究方法基礎上進行適當修改。84只健康雄性昆明小鼠適應飼養(yǎng)環(huán)境后，隨機分成7組(n=12)：對照組、模型組、陽性對照組、NOB低劑量組(25 mg/kg)、NOB中劑量組(50 mg/kg)、NOB高劑量組(100 mg/kg)和PMFs提取物組(250 mg/kg)。在LPS滴鼻誘導前對川陳皮素高、中、低劑量組和PMFs提取物組連續(xù)灌胃7 d，每天固定時間給藥1次，同時對照組、模型組和陽性對照組給予等體積的生理鹽水。陽性對照組在第7 天造模前腹腔注射地塞米松磷酸鈉(10 mg/kg)，1 h后對模型組、陽性對照組、NOB高中低劑量組和PMFs提取物組滴鼻LPS(8 mg/kg)溶液，空白組給予同體積的生理鹽水。造模6 h后處死。該研究獲得了華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心的倫理學批準。

6)樣本采集。小鼠眼眶靜脈叢取血，室溫靜置1 h，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，獲得小鼠血清，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。之后脫頸處死，快速取出完整肺組織，于冰冷的滅菌生理鹽水中迅速漂洗干凈，用濾紙吸取多余水分。取右肺上葉組織放入4%多聚甲醛液中固定，室溫保存，用于組織病理學觀察；左肺用于測定肺濕/干質(zhì)量比；其余肺組織立即放入液氮，試驗結束后轉入-80 ℃冰箱，備用。

7)肺組織病理學觀察及肺損傷評分。將固定24 h后的右肺上葉組織取出，脫水、包埋、切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。參照Nishina等[9]介紹的方法進行肺損傷評分，每張切片選擇3個不同視野，取平均值統(tǒng)計分析。

8)肺濕/干質(zhì)量比。將取出的左肺在生理鹽水漂洗過后，用濾紙吸干肺組織表面水分，稱濕質(zhì)量，之后放入60 ℃的烘箱中，烘干48 h，再次稱肺組織干質(zhì)量，2組數(shù)據(jù)相除后所得即為濕/干質(zhì)量比(W/D)。

9)肺組織中氧化損傷指標的測定。從-80 ℃冰箱中取出適量肺組織，制備肺組織勻漿。嚴格按照BCA蛋白測定試劑盒制造商的說明書，測量肺組織勻漿液中蛋白質(zhì)的水平。MDA、MPO、GSH-PX均可通過試劑盒顯色作用呈現(xiàn)出特殊顏色，通過特定波長可檢測出吸光度，再與標準品結合測定樣品MDA、MPO、GSH-PX的含量或活力。

10)血清中細胞因子含量的測定。按ELISA試劑盒說明書操作，對各小組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 細胞因子進行測定。在450 nm波長處測定OD值，根據(jù)標準曲線計算其分泌量。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 D101大孔吸附樹脂的分離純化

將純化前后的PMFs粗提物溶液進行高效液相色譜檢測，結果如圖1所示。經(jīng)過D101大孔樹脂吸附后，廣陳皮PMFs粗提物中PMFs成分種類未出現(xiàn)顯著增加或減少，PMFs較完整地保留下來，主要為川陳皮素和桔皮素，而極性較大物質(zhì)如色素、黃烷酮等其他雜質(zhì)成分經(jīng)過純化后明顯減少，樣液顏色淺而澄清。D101大孔樹脂吸附前后粗提物中PMFs的組分及含量變化情況如表1所示。富集后川陳皮素和桔皮素分別增加了3.7倍和3.1倍，可知D101大孔樹脂可以有效吸附PMFs，實現(xiàn)富集純化。

圖1 D101大孔樹脂吸附PMFs粗提物前(A)、吸附后(B)、川陳皮素標品(C)、桔皮素標品(D)的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of D101 resin absorbed PMFs before (A),after (B),nobiletin standard (C) and tangeretin standard (D)

表1 D101大孔吸附樹脂富集前后PMFs粗提物的含量變化Table 1 Changes of PMFs extract contentbefore and after enrichment by D101 resin

2.2 高速逆流色譜制備川陳皮素和桔皮素

用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶0.8∶1∶1，V/V)體系分離PMFs粗提物的川陳皮素和桔皮素，分離時間為240 min，經(jīng)分離得到2個主要峰：峰A和峰B，保留率73%，分離效果良好。根據(jù)色譜分段收集并檢測，峰A和峰B 2個化合物的純度分別為95.08%和98.01%，結果見圖2。旋蒸去溶劑后凍干稱質(zhì)量，分別為7.12、5.83 mg。

圖2 HSCCC主要峰(A，B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the main peaks (A,B) of HSCCC

2.3 化合物結構鑒定

對圖2中的峰A和峰B進行1H NMR和UPLC-QTOF-MS/MS測定，結果如下：

峰A：ESI-MS (m/z)：403[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ 7.58 (dd,J=8.4,2.1 Hz,1H)，7.42 (d,J=2.1 Hz,1H)，7.00 (d,J=8.4 Hz,1H)，6.63 (s,1H)，4.11 (s,3H)，4.03 (s,3H)，4.01～3.94 (m,12H)。其光譜數(shù)據(jù)與文獻[10-12]報道對照基本一致，故組分A鑒定為川陳皮素。

峰B：ESI-MS (m/z)：373[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ 7.88 (d,J=9.0 Hz,2H)，7.03 (d,J=9.1 Hz,2H)，6.61 (s,1H)，4.10 (s,3H)，4.02 (s,3H)，3.95 (d,J=0.8 Hz,6H)，3.89 (s,3H)。其光譜數(shù)據(jù)與文獻[10-12]報道對照基本一致，故組分B鑒定為桔皮素。

通過以上分析結果可知，在PMFs提取物中80%約為川陳皮素和桔皮素的混合物，其中川陳皮素含量約占50%，桔皮素約占30%，說明川陳皮素是廣陳皮中主要的PMFs，且所得川陳皮素純度可達95%以上。

2.4 ALI小鼠肺組織病理學觀察

LPS誘導的小鼠急性肺損傷的嚴重程度可以通過肺組織的病理學觀察反映出來。如圖3所示，對照組小鼠肺組織結構正常，肺泡壁薄，肺泡腔清晰可見，未出血和炎性細胞浸潤。與對照組對比，模型組小鼠在LPS滴鼻6 h之后肺組織中肺泡壁和間隔增厚，有大量炎性細胞浸潤，損傷明顯，肺損傷評分顯著升高，說明造模成功。與模型組相比，中劑量川陳皮素組肺組織形態(tài)結構較為正常，中性粒細胞浸潤程度明顯減輕，無明顯病理性損傷，可初步推測川陳皮素對急性肺損傷具有一定的保護作用。

2.5 ALI小鼠肺損傷評分和肺組織濕/干質(zhì)量比

肺的濕/干質(zhì)量比可以反映肺水腫的嚴重程度。如圖4所示，模型組肺組織濕/干質(zhì)量比明顯高于對照組(P<0.01)。相比之下，中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組有效降低了LPS誘導的ALI小鼠肺組織的濕/干質(zhì)量比(P<0.01)。

A:對照組;B:模型組;C:陽性對照組;D:25 mg/kg NOB低劑量組;E:50 mg/kg NOB中劑量組;F:100 mg/kg NOB高劑量組;G:250 mg/kg PMFs提取物組。A:Control group;B:Model group;C:DEX group;D:25 mg/kg NOB group;E:50 mg/kg NOB group;F:100 mg/kg NOB group;G:250 mg/kg PMFs group.

*(P<0.05) 或**(P<0.01)表示和對照組相比，#(P<0.05)或##(P<0.01)表示和LPS組相比。下同。*(P<0.05) or **(P<0.01) compared with control group,# (P<0.05) and ## (P<0.01) compared with the LPS group. The same as below.

2.6 ALI小鼠肺組織氧化損傷指標的檢測結果

如圖5所示，與對照組相比，模型組的MPO活性和MDA含量顯著上升(P<0.01)，GSH-PX的活性顯著下降(P<0.01)。然而，中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組使MPO和MDA的含量和活性顯著下降，GSH-PX的活性顯著上升。

圖5 NOB和PMFs作用下的ALI小鼠肺組織中MDA(A)、MPO(B)和GSH-PX(C)的活性變化Fig.5 Changes of MDA(A),MPO(B) and GSH-PX(C) in lung tissue of ALI mice under the action of NOB and PMFs

2.7 ALI小鼠血清中細胞因子含量

為評估LPS刺激下炎癥細胞因子的水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定TNF-α、IL-6和 IL-1β在蛋白水平上的表達。如圖6所示，與對照組相比，LPS可顯著增加TNF-α、IL-6和IL-1β促炎因子的含量(P<0.01)。高、低劑量川陳皮素組對于降低TNF-α的含量沒有顯著性差異，不具有統(tǒng)計學意義，但中劑量川陳皮素組和PMFs提取物組則顯著改善模型組炎癥因子的表達(P<0.01)，阻止這些炎癥細胞因子的釋放。

圖6 NOB和PMFs作用下的ALI小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量變化Fig.6 Changes of TNF-α,IL-6 and IL-1βcontentin serum of ALI mice under the action of NOB and PMFs

3 討 論

3.1 PMFs對小鼠肺組織損傷程度、肺組織濕/干質(zhì)量比的影響

本研究表明，LPS的刺激導致了以肺泡為主的炎性肺損傷，肺組織病理特征異常改變，氧化損傷指標和促炎因子顯著上升，主要是中性粒細胞的活化會促進肺部細胞毒產(chǎn)物的表達，如機體氧自由基和顆粒酶的過量產(chǎn)生。Chignard等[13]研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞可以增加ALI小鼠肺屏障通透性，本研究也證實小鼠經(jīng)LPS滴鼻后，肺組織被大量中性粒細胞浸潤。而經(jīng)過連續(xù)灌胃7 d的小鼠情況有所好轉，發(fā)現(xiàn)PMFs提取物和川陳皮素可有效緩解LPS誘導的小鼠肺組織損傷，減少中性粒細胞聚集，降低肺濕/干質(zhì)量比，說明PMFs提取物和川陳皮素可防止富含蛋白質(zhì)的水腫液滲透到肺組織中。這與Li等[14]采用20 mg/kg川陳皮素滴鼻后，肺濕/干質(zhì)量比也顯著下降的研究結果一致，說明川陳皮素和PMFs對小鼠肺組織具有一定的保護作用。

3.2 PMFs對小鼠肺組織氧化損傷指標的影響

本研究結果表明，PMFs提取物和川陳皮素使MDA含量和MPO活性下降，GSH-PX活性上升。這與Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過抑制NF-κB信號通路減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷，同時降低MPO活性的研究是類似的。由此推測，川陳皮素和PMFs可以通過減少氧自由基生成、減弱肺組織的中性粒細胞的積累，起到保護小鼠肺組織的作用。同時，細胞膜的正常結構被細胞膜脂質(zhì)過氧化破壞后能進一步損傷肺泡中的毛細血管，使血管滲透性增強，內(nèi)皮細胞完整性被破壞，導致水和大分子成分外滲[16]，最后形成肺水腫，這與上述研究結果也吻合。

3.3 PMFs對小鼠血清中細胞因子含量的影響

細胞因子分析結果表明,PMFs提取物和川陳皮素可顯著緩解LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子的產(chǎn)生。Liu等[17]采用橙皮苷灌胃ALI小鼠，測定4 h和24 h肺泡灌洗液中的TNF-α和 IL-6含量，同樣發(fā)現(xiàn)其能夠顯著降低促炎因子的表達。說明黃酮類化合物對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有一定的抗炎作用。因PMFs特殊的結構，相比于黃酮類化合物，多甲氧基基團的低極性決定了其具有高疏水特性及較強的滲透性，更易穿過磷脂雙分子層進入細胞膜內(nèi)發(fā)揮作用，被人體吸收，促進細胞的代謝活力，從而發(fā)揮更強的抗炎效果。

PMFs在生物體內(nèi)發(fā)生的生物轉化并產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物也可能對LPS誘導的ALI具有一定的抑制作用。早期研究顯示桔皮素能以非競爭方式抑制某些細胞色素P450酶在人肝臟微粒體中的表達[18]。PMFs代謝的關鍵酶系就是細胞色素P450，能催化羥基化和去甲基化反應。有研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素的去甲氧基速度緩慢，半衰期達24 h以上，表明其在體內(nèi)的半衰期可能相當長。Obermeier等[19]研究發(fā)現(xiàn)3′-去甲氧基川陳皮素、4′-去甲氧基川陳皮素和3′，4′-二羥基-5，6，7，8-四甲氧基黃酮是川陳皮素在CD-1小鼠尿樣和血漿中的代謝產(chǎn)物，并且這些代謝產(chǎn)物與其母體化合物川陳皮素相比，對LPS誘導的iNOS和COX-2表達具有更強的抑制作用。由此推測川陳皮素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷可能是與代謝產(chǎn)物共同作用的結果。

上述研究結果發(fā)現(xiàn)，PMFs提取物組和不同劑量川陳皮素組對急性肺損傷小鼠的保護效果從高到低依次是：中劑量組、PMFs提取物組、高劑量組和低劑量組。推測高劑量組效果不如中劑量組的原因可能是50 mg/kg已達到川陳皮素發(fā)揮作用的最大值，超過該值后作用效果減弱或趨于無效。另外，也可能是劑量過大抑制了相關信號通路的負反饋調(diào)節(jié)[20]，導致效果下降。早期體外吸收試驗發(fā)現(xiàn)，川陳皮素優(yōu)先沉積在Caco-2細胞單層中[21]，孵育4 h后發(fā)現(xiàn)48%以上的川陳皮素滲透入基側(門靜脈)內(nèi)，說明川陳皮素具有高度滲透性能，更容易在細胞內(nèi)沉積。由此推測，滲透率可能是導致中劑量組川陳皮素比PMFs提取物組作用效果稍強的原因之一。

本試驗從廣陳皮PMFs提取物出發(fā)，與現(xiàn)有研究直接用標準品灌胃相比，能更加真實客觀地反映廣陳皮中功能因子對急性肺損傷小鼠的保護作用，并與川陳皮素進行對比，研究二者的差異，為廣陳皮中功能性成分的開發(fā)和研究提供理論參考。試驗結果表明，PMFs提取物可通過抑制誘因，減弱或消除氧自由基、促炎細胞因子及炎癥介質(zhì)的過度釋放導致的損傷，改善微循環(huán)，起到對肺組織細胞的保護作用。此外，對比PMFs提取物，川陳皮素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用更強，推測川陳皮素可能是PMFs提取物中的主要功能因子。今后還需進一步探討川陳皮素對細胞因子基因表達的影響以及對MAPK和NF-κB等信號通路的作用機制。