方慧祥 崔慶德 呂晉

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法同時測定益腎靈顆粒（無蔗糖）中特女貞苷、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素含量的方法。方法：色譜柱為依利特 C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃;流動相為甲醇-乙腈-水，梯度洗脫;流速為1.0mL·min-1; 檢測波長為224nm、270nm 、246nm。結(jié)果：特女貞苷、、淫羊藿苷補骨脂素、異補骨脂素的進樣量分別在0.03401～0.8501μg（r=0.9997，n=7）、0.1006～2.5151μg （r=1.0000，n=7）、0.01916～0.4790μg（r=0.9999，n=7）、0.02020～0.5051μg （r=0.9999，n=7）范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的RSD均<1.0%;平均加樣回收率分別為98.5%、100.6%、99.4%、98.9%，RSD分別為0.50%、0.93%、0.49%、0.65%（n=6）。結(jié)論：本方法專屬性強、精密度高、分離度及重現(xiàn)性好，可用于測定益腎靈顆粒（無蔗糖）中特女貞苷、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法;益腎靈顆粒（無蔗糖）;特女貞苷;淫羊藿苷;補骨脂素;異補骨脂素;含量測定

Abstract：Objective To establish a method for content determination of Specnuezhenide，Psoralen，Angelicin and Icariin in Yishenling granules simultaneously. Methods The determination was performed on Yilite C18 column（250mm×4.6mm，5μm）with mobile phase consisted of methanol- acetonitrile-water at the flow rate of 1.0mL/min. The column temperature was 30℃，and the detection wavelengths were set at 224nm，246nm and 270nm. Results The method achieved good linearity in the ranges of 0.03401～0.8501μg（r=0.999 7，n=7）for Specnuezhenide，0.01916～0.4790μg（r=0.9999，n=7）for Psoralen，0.02020～0.5051μg （r=0.999 9，n=7）for Angelicin and 0.1006～2.5151μg （r=1.0000，n=7）for Icariin. The RSDs of precision，reproducibility and stability tests were lower than 1.0%. The average recoveries were 98.5%，99.4%，98.9% and 100.6%，the RSDs were 0.50%，0.49%，0.65%and 0.93%（n=6）. Conclusions The method is specific，precise and reproducible. It can be used for the content determination of Specnuezhenide，Psoralen，Angelicin and Icariin in Yishenling granules.

Keywords：HPLC;Yishenling Granules（Sucrose-free）;Specnuezhenide;Icariin;Psoralen;Angelicin;Content Determination

益腎靈顆粒為中國藥典[1]收載品種，由枸杞子、女貞子、附子（制）、芡實（炒）、車前子（炒）、補骨脂（炒）、覆盆子、五味子、桑椹、沙苑子、韭菜子（炒）、淫羊藿、金櫻子十三味中藥材組成。益腎靈顆粒具有溫陽補腎之功效，用于腎氣虧虛、陽氣不足所致的陽痿、早泄、遺精或弱精癥。淫羊藿和補骨脂均為方中君藥，女貞子為方中臣藥，現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子有促進生長[2]、增強體質(zhì)[3]、強心[4]等作用;補骨脂有抗腫瘤[5] 、抗骨質(zhì)疏松[6] 、抗氧化[7] 等作用;淫羊藿有促進生殖[8]、提高免疫[9]、增加骨密度[10]、抗腫瘤[11]等作用。特女貞苷為女貞子的主要成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗衰老等作用，補骨脂素和異補骨脂素為補骨脂的主要成分，具有植物雌激素作用;淫羊藿苷為淫羊藿的主要成分，具有滋陰補陽、促進造骨細(xì)胞增殖等作用，中國藥典[1]選擇特女貞苷、補骨脂素和異補骨脂素、淫羊藿苷分別作為女貞子、補骨脂、淫羊藿三種藥材的含量測定指標(biāo)。有文獻(xiàn)[12]報道HPLC法同時測定益腎靈顆粒中補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，但同時測定君藥淫羊藿和補骨脂以及臣藥女貞子中淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素和特女貞苷的含量未見報道。本實驗參考中國藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[12-18]，建立HPLC切換波長法同時測定益腎靈顆粒（無蔗糖）中特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀（配有LC-20AT型輸液泵，CBM-20A型控制器， SIL-20A型自動進樣器，CTO-10AS vp型柱溫箱，SPD-20A型紫外檢測器，DGU-20A5型脫氣機，LCsolution色譜工作站）（日本島津制作所），XS105型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 材料 特女貞苷對照品（批號：111926-201605，含量：93.3%），補骨脂素對照品（批號：110739-201617，含量：99.7%），異補骨脂素對照品（批號：110738-201614，含量：99.9%），淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，含量：94.2%），均購置于中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純（德國默克公司）;水為雙蒸水;其余試劑均為分析純;益腎靈顆粒（無蔗糖）（福建省泉州恒達(dá)制藥有限公司，批號： 20150409、20160324、20160913）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特 C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃;流動相：甲醇（A） -乙腈（B）-水（C），梯度洗脫（25%A始終保持不變;0～35min，7% B→19% B，35～50min，19% B→19% B，50.01～60min，7% B→7% B）;流速為1.0 mL·min-1; 檢測波長：0～20min，224nm（特女貞苷）;20～35min，246nm（補骨脂素、異補骨脂素）;35～60min，270nm（淫羊藿苷）;進樣量：10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取特女貞苷、淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品22.78mg、66.75mg 、12.01mg、12.64mg置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品儲備液（質(zhì)量濃度： 特女貞苷為0.4251mg·mL-1，淫羊藿苷為1.2576mg·mL-1，補骨脂素為0.239 5mg·mL-1，異補骨脂素為0.2525mg·mL-1），精密量取混合對照品儲備液1mL，置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品使用液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取益腎靈顆粒（無蔗糖）5袋，精密稱定，研細(xì)，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50mL，稱定重量，置水浴上回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減少的重量，搖勻，靜置，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例及工藝，分別制得缺女貞子、缺補骨脂、缺淫羊藿的陰性對照，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL， 分別置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，即得。分別進樣10μL，記錄峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，分別得特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷回歸方程為y=1268121.8x+250.4，r=0.9997（n=7）;y=7680626.9x+1180.9，r=0.9999（n=7）;y=7581018.9x+4347.4，r=0.9999（n=7）;和y=2297168.2x+1699.7，r=1.0000（n=7）。結(jié)果表明，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的進樣量分別在0.03401～0.8501μg、0.01916～0.4790μg、0.02020～0.5051μg、和0.1006～2.5151μg的范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系?；旌蠈φ掌?、供試品及陰性對照的色譜圖如圖1所示。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過的供試品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.74%、0.56%、0.58%和0.43%。表明儀器精密度良好。

2.3.3 空白試驗 吸取“2.2.3”項下的陰性對照溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果顯示，陰性對照在與對照品和供試品色譜峰保留時間相應(yīng)位置上，沒有相應(yīng)的色譜峰，表明陰性對照不干擾測定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：20160324）6份，按“2.2.2”項下制備，測定特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，其含量的RSD分別為0.75%、0.86%、0.79%和0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下制備好的同一份樣品，分別在0、2、4、8、16、24、36h進樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.96%、0.69%、0.73%和0.55%，表明樣品在36h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的益腎靈顆粒（無蔗糖）（批號：20160324）6份，每份約3g，精密稱定，精密加入“2.2.1”項下的混合對照品儲備液1mL，再精密加入60%乙醇49mL，按“2.2.2”項下操作。測得加樣回收率見表1。

2.3.7 樣品測定結(jié)果 分別取3批益腎靈顆粒（無蔗糖），按“2.2.2”項下的方法操作，測定含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 參考中國藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]，以提取溶劑（甲醇和乙醇）、提取溶劑濃度（40%、60%、80%、100%）、提取方法（超聲和回流）、提取時間（20min、40min、60min、80min）為試驗因素進行正交試驗，發(fā)現(xiàn)用60%的乙醇回流提取1 h效果最好。從而確定用60%的乙醇回流提取1 h為本試驗的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇 分別取特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷對照品溶液在200～500nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷分別在224nm、246nm、246nm和270nm處有最大吸收。為簡化方法，參考中國藥典[1]及文獻(xiàn)[12-13，17-18]使用的檢測波長，進行單波長同時檢測以上四個成分，當(dāng)用224nm波長時，補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷響應(yīng)值偏低，當(dāng)用246nm時，特女貞苷和淫羊藿苷響應(yīng)值偏低，當(dāng)用270nm時，特女貞苷、補骨脂素和異補骨脂素響應(yīng)值偏低，不利于定量測定，故最終定為切換波長法進行測定。

3.3 流動相的選擇 曾嘗試用甲醇-水系統(tǒng)或乙腈-水系統(tǒng)進行分離，當(dāng)采用甲醇-水系統(tǒng)時異補骨脂素的保留時間與淫羊藿苷的保留時間相差太遠(yuǎn)，浪費分析時間，當(dāng)采用乙腈-水系統(tǒng)時異補骨脂素的保留時間與淫羊藿苷的保留時間相差太近，不利于切換波長，最后采用甲醇-乙腈-水系統(tǒng)得到良好效果，因此本試實驗最終將流動相甲醇-乙腈-水進行梯度洗脫。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，益腎靈顆粒對改善少、弱精男性的精液質(zhì)量有較好的臨床療效。益腎靈顆粒中淫羊藿為補腎壯陽之要藥，具有補腎陽的功效，補骨脂具有溫腎助陽的功效，女貞子具有滋補肝腎的功效。中成藥的臨床療效是來自組方中各味中藥的綜合作用，為保證臨床療效，同時控制多味中藥質(zhì)量顯得尤為重要。本方法能同時測定益腎靈顆粒（無蔗糖）中特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，對保證益腎靈顆粒臨床療效發(fā)揮積極作用。

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