劉鵬，車子凡，張徐祥

(污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

近年來(lái)，全球范圍內(nèi)介水傳染病的暴發(fā)已嚴(yán)重危害到各國(guó)人民生命健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年因介水傳染病而死亡的人數(shù)超過(guò)200萬(wàn)人，其中58%的死亡病例與安全飲用水的缺乏、惡劣的環(huán)境衛(wèi)生和個(gè)人衛(wèi)生狀況有關(guān)[1]。介水傳染病的病原體主要包括細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和寄生蟲等，其中病毒具有更強(qiáng)的傳染性，對(duì)常規(guī)水處理工藝的耐受性更強(qiáng)，對(duì)人體健康的威脅更大。因此，加強(qiáng)對(duì)水環(huán)境中病毒的監(jiān)測(cè)，對(duì)于控制病毒的環(huán)境傳播，降低疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，保障人體健康，具有重要意義。

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)對(duì)水環(huán)境中病原微生物的監(jiān)測(cè)一直依賴于糞便指示菌的檢測(cè)。但是，以糞大腸菌群、大腸埃希氏桿菌等為代表的糞便指示菌很難準(zhǔn)確反映水環(huán)境中病原微生物尤其是病毒的污染水平[2-4]。為保證水環(huán)境的生物安全，必須建立高效、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)的病毒檢測(cè)方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的直接檢測(cè)。近年來(lái)，針對(duì)水環(huán)境中病毒的檢測(cè)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，不同研究之間采用的檢測(cè)方法存在較大差異?，F(xiàn)重點(diǎn)總結(jié)了水環(huán)境中病毒富集方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，以期為水環(huán)境中病毒檢測(cè)與控制提供方法學(xué)支撐。

1 病毒富集方法

與臨床樣品相比，水環(huán)境中病毒含量較低，因此，對(duì)其檢測(cè)必須依賴高效的前處理方法，通過(guò)富集濃縮提高待測(cè)樣品中病毒的濃度，從而提高病毒的檢測(cè)能力。相比于細(xì)菌，水環(huán)境中病毒的尺寸更小，其平均尺寸一般不超過(guò)100 nm。因此，水環(huán)境中細(xì)菌富集常用的微孔濾膜過(guò)濾法，對(duì)病毒的富集效果不佳。目前，常用于水環(huán)境中病毒的富集方法主要包括過(guò)濾法、吸附法、離心法和混凝法等。

1.1 過(guò)濾法

過(guò)濾法的原理是利用孔徑小于病毒顆粒尺寸的濾膜對(duì)病毒顆粒進(jìn)行截留，類似于使用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜富集水體中的細(xì)菌。Wang等[5]利用孔徑分別為0.45，0.2和0.1 μm的微孔濾膜對(duì)污水處理廠污水進(jìn)行分級(jí)過(guò)濾，僅保留0.1 μm 的微孔濾膜用于病毒分析。該方法原理清晰，所需實(shí)驗(yàn)器材較少，但由于微孔濾膜過(guò)水面積和孔徑均較小，極易出現(xiàn)濾膜堵塞現(xiàn)象。此外，該方法僅獲得尺寸介于0.1～0.2 μm的病毒顆粒，對(duì)于尺寸>0.2 μm(如埃博拉病毒[6]、煙草花葉病毒[7]等)或尺寸<0.1 μm(如輪狀病毒[8]、甲肝病毒[9]和寨卡病毒[10]等)的病毒顆粒無(wú)法有效富集。

切向流過(guò)濾技術(shù)能有效克服垂直過(guò)濾法過(guò)水面積小、濾膜易堵塞的缺點(diǎn)，用于處理較大體積的水環(huán)境樣品[11]。使用0.2 μm和99.97 ku孔徑的兩級(jí)濾膜，分別實(shí)現(xiàn)水樣中細(xì)菌等大尺寸顆粒物的去除和病毒顆粒的富集，濾膜過(guò)水面積達(dá)1 m2，一次性可處理100 L水樣。目前，該方法已用于海水[12]和回用水[13]等樣品的處理，能較好地富集病毒顆粒。但切向流過(guò)濾系統(tǒng)較為復(fù)雜，使用成本高，樣品處理耗時(shí)較長(zhǎng)，單個(gè)樣品處理時(shí)間需10 h以上，且過(guò)濾處理后的水樣體積仍超過(guò)50 mL，需依賴密度梯度離心等濃縮方法進(jìn)行后續(xù)處理[11]。

1.2 吸附法

吸附法是利用水中病毒顆粒攜帶一定的電荷，能吸附于荷電濾膜表面的特點(diǎn)，對(duì)水樣中病毒顆粒進(jìn)行富集的方法。吸附于濾膜表面的病毒顆?？赏ㄟ^(guò)較小體積緩沖液洗脫，從而達(dá)到富集的目的。根據(jù)濾膜表面攜帶電荷的差異，濾膜主要包括正電荷濾膜和負(fù)電荷濾膜。

病毒顆粒的等電點(diǎn)一般介于3.5～7[14]，因此，在弱酸、中性或者堿性水樣中，病毒顆粒攜帶負(fù)電，能直接吸附于正電荷濾膜表面。常用的正電荷濾膜包括NanoCeram濾膜和1MDS濾膜。1MDS濾膜最早用于水樣中病毒顆粒的富集，在河水和飲用水中均得到廣泛應(yīng)用[15]，對(duì)飲用水中?？刹《?型的平均回收率為33%[16]，而對(duì)河水和飲用水中脊髓灰質(zhì)炎病毒的加標(biāo)回收率分別為36%和67%[17]。1MDS濾膜使用方便，不需要對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理，處理水樣體積大(超過(guò)1 000 L)，且不易堵塞。但是，該濾膜價(jià)格高昂，單個(gè)濾膜價(jià)格超過(guò)200美元，日常監(jiān)測(cè)使用成本過(guò)高。

NanoCeram濾膜是一種材質(zhì)為氧化鋁纖維的正電荷濾膜，價(jià)格低于1MDS濾膜，并且能取得不亞于1MDS濾膜的病毒回收效果。通過(guò)向污水處理廠出水中添加脊髓灰質(zhì)炎病毒，分別使用1MDS濾膜和NanoCeram濾膜對(duì)病毒進(jìn)行富集，2種濾膜對(duì)病毒的截留效率分別超過(guò)97%和89%，而NanoCeram濾膜的洗脫效率和洗脫液二次濃縮回收率要高于1MDS濾膜，1MDS濾膜和NanoCeram濾膜的整體回收率為23%和57%[18]。Karim等[17]比較了2種濾膜對(duì)飲用水和河水中脊髓灰質(zhì)炎病毒和諾瓦克病毒的回收效率，同樣發(fā)現(xiàn)NanoCeram濾膜對(duì)病毒的回收率不低于1MDS濾膜。NanoCeram濾膜對(duì)不同病毒的回收率也存在一定差異。Pang等[19]發(fā)現(xiàn)對(duì)柯薩奇病毒、埃可病毒、諾如病毒、輪狀病毒和腺病毒41型的回收率分別為41%～67%，22%～90%，23%～44%，24%～46%和24%～35%。Gibbons等[20]對(duì)40 L海水中病毒進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)NanoCeram濾膜對(duì)諾如病毒和腺病毒的截留效率均高于98%，但是對(duì)腺病毒的洗脫效率較差，導(dǎo)致腺病毒的回收率不超過(guò)3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于諾如病毒96%的回收率。

正電荷濾膜可直接用于吸附病毒顆粒，而負(fù)電荷濾膜用于吸附病毒顆粒時(shí)需對(duì)水樣進(jìn)行一定的處理。一般情況下，病毒顆粒攜帶負(fù)電荷，可以通過(guò)向水中添加一定濃度的Mg2+或Al3+等多價(jià)陽(yáng)離子，通過(guò)陽(yáng)離子架橋作用使病毒顆粒吸附于負(fù)電荷濾膜表面[21]。當(dāng)病毒顆粒吸附于濾膜表面后，使用一定濃度的稀硫酸淋洗濾膜去除陽(yáng)離子，同時(shí)將pH值降低至病毒顆粒等電點(diǎn)以下，此時(shí)病毒顆粒攜帶正電荷，從而直接吸附于濾膜表面。最后，通過(guò)較小體積的NaOH溶液洗脫病毒顆粒完成富集過(guò)程。或者直接將水樣pH值調(diào)節(jié)至3.5左右，低于病毒顆粒等電點(diǎn)，使得病毒顆粒攜帶正電荷，從而直接吸附于濾膜表面[22]，再直接使用NaOH溶液洗脫病毒顆粒。通過(guò)使用添加Mg2+的方法處理水樣，負(fù)電荷濾膜對(duì)病毒加標(biāo)后的250～500 mL超純水、自來(lái)水、瓶裝水、河水以及池塘水中的諾如病毒回收率分別為186%，80%，167%，15%和39%，高于對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒的回收率[21]。與正電荷濾膜相比，負(fù)電荷濾膜對(duì)大部分病毒的回收率更高，使用更為便捷，價(jià)格更為便宜，而其最大的劣勢(shì)在于很難處理大體積水樣，其處理能力一般不超過(guò)10 L[15]。近年來(lái)，Hata等[23]設(shè)計(jì)了一種筒式混合纖維酯材質(zhì)的負(fù)電荷濾膜，其處理體積可達(dá)1 000 L，對(duì)河水和自來(lái)水中病毒的回收率為10%～54%。

除濾膜外，一些特殊材質(zhì)的填料也可被用于病毒的吸附，比如硅膠[24]、硅藻土[25]、玻璃纖維[26]和活性炭[27]等。Lambertini等[26]使用玻璃纖維對(duì)飲用水中病毒進(jìn)行富集，對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒18型、腺病毒41型和諾如病毒的回收分別為70%，14%，19%，21%和29%。

1.3 離心法

使用過(guò)濾法和吸附法對(duì)病毒進(jìn)行富集，可得到體積在10～500 mL的病毒濃縮液，但需進(jìn)一步濃縮。對(duì)于體積較小的樣品，可以直接使用超高速離心法進(jìn)行處理[27-30]。Kapoor等[28]與Victoria等[29]分別使用35 000 g離心3 h和22 000 g離心2 h進(jìn)行病毒有效分離。超高速離心法富集適用于體積較小的樣品，且依賴于超高速冷凍離心機(jī)。

1.4 混凝法

混凝法是通過(guò)添加混凝劑，使水中的膠體粒子與病毒顆粒結(jié)合，再通過(guò)離心沉降富集病毒顆粒的方法。常見(jiàn)的混凝劑可分為有機(jī)混凝劑和無(wú)機(jī)混凝劑，有機(jī)混凝劑如PEG8000[31]、脫脂奶粉[32]、牛肉膏[33-34]等，無(wú)機(jī)混凝劑如氯化鐵[35-36]、氯化鋁[37]。通過(guò)添加混凝劑，可以在較低離心轉(zhuǎn)速下實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的沉降和分離，擺脫對(duì)超高速冷凍離心機(jī)的依賴。

2 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的病毒檢測(cè)方法

環(huán)境病毒學(xué)肇始于20世紀(jì)對(duì)污水和飲用水中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)，其研究目的是為評(píng)估脊髓灰質(zhì)炎病毒的環(huán)境行為以及公共安全風(fēng)險(xiǎn)[38]。由于病毒本身沒(méi)有繁殖能力，嚴(yán)格依賴宿主細(xì)胞，因此早期病毒檢測(cè)多依賴傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法，實(shí)驗(yàn)中需通過(guò)觀測(cè)細(xì)胞病變來(lái)判斷。然而，由于多數(shù)病毒難以培養(yǎng)，如肝炎病毒和諾瓦克病毒等，部分病毒培養(yǎng)過(guò)程中宿主細(xì)胞很難出現(xiàn)明顯的病變反應(yīng)，且病毒侵染細(xì)胞的過(guò)程較長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)病毒快速、敏感和便捷的檢測(cè)。分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)病毒快速、靈敏和特異的檢測(cè)提供了可能。

針對(duì)不同的病毒設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，采用普通PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)可直接對(duì)病毒進(jìn)行定性檢測(cè)。Verheyen等[39]利用PCR和RT-PCR技術(shù)對(duì)287處水源水中腺病毒和輪狀病毒進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2種病毒的陽(yáng)性率分別為12.9%和2.9%。除了普通PCR和RT-PCR，病毒檢測(cè)還包括巢式PCR(Nested PCR)、多重PCR(Multiplex PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)、細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)PCR(Integrated cell culture PCR，ICC-PCR)和數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)等。

2.1 巢式PCR

為提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，在普通PCR的基礎(chǔ)上開發(fā)出了巢式PCR技術(shù)。通過(guò)2輪PCR反應(yīng)，使用2套引物擴(kuò)增特異性DNA片斷，其中第2對(duì)引物能特異性地?cái)U(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物中的一段DNA片斷。Lam等[40]通過(guò)巢式PCR檢測(cè)了包括甲型流感病毒在內(nèi)的21種呼吸道病毒，結(jié)果表明其靈敏度是普通PCR的100～1 000倍。

2.2 多重PCR

針對(duì)普通PCR僅能檢測(cè)單個(gè)病毒的缺點(diǎn)，多重PCR技術(shù)通過(guò)在單個(gè)PCR反應(yīng)中設(shè)計(jì)多個(gè)引物，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒的檢測(cè)[41]。Hao等[42]開發(fā)出2套引物體系，實(shí)現(xiàn)了犬類4種呼吸道病毒和4種腸道病毒的同時(shí)檢測(cè)。然而，不同引物退火溫度的差異導(dǎo)致多重PCR很難達(dá)到最佳反應(yīng)條件。某些情況下，仍需依賴寡核苷酸雜交技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性進(jìn)行驗(yàn)證[43]。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

普通PCR只能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定性檢測(cè)，而qPCR通過(guò)收集PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。根據(jù)使用熒光物質(zhì)的不同，可以分為染料法和探針?lè)?類[44]。與染料法相比，探針?lè)ㄐ桀~外使用探針序列對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，特異性更強(qiáng)，目前在環(huán)境病毒檢測(cè)中的應(yīng)用最為廣泛[36]。

2.4 細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)PCR

將細(xì)胞培養(yǎng)和PCR相結(jié)合，用于環(huán)境中具有實(shí)際感染能力病毒的檢測(cè)。原理是通過(guò)PCR方法快速檢測(cè)病毒感染宿主后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的病毒核酸來(lái)檢測(cè)具有感染性的病毒，比單純的細(xì)胞培養(yǎng)法和PCR方法更靈敏。Ryu等[45]利用綠猴腎細(xì)胞系(buffalo green monkey kidney，BGMK)對(duì)柯薩奇病毒A10型、?？刹《?0型、脊髓灰質(zhì)炎病毒和腸病毒70型進(jìn)行培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變，再提取病毒核酸利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。與細(xì)胞培養(yǎng)法相比，ICC-PCR能夠大大縮短檢測(cè)時(shí)間，但仍存在無(wú)法精確定量的問(wèn)題。

2.5 數(shù)字PCR

近年來(lái)，dPCR在病原微生物的檢測(cè)中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。dPCR是一種基于單分子PCR進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量方法，采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)后，有1個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器會(huì)給出熒光信號(hào)，而沒(méi)有模板的反應(yīng)器則無(wú)熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)的相對(duì)比例和反應(yīng)器體積推算原始溶液的核酸濃度[50]。與qPCR技術(shù)相比，該方法對(duì)目的基因片段的定量不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且具有更低的檢測(cè)限和靈敏度。在生菜和飲用水甲型肝炎病毒和諾如病毒的檢測(cè)中，dPCR對(duì)病毒的靈敏度不低于qPCR，并且在PCR抑制劑存在的情況下仍可獲得穩(wěn)定的定量結(jié)果[51]。

采用基于PCR的方法檢測(cè)實(shí)際環(huán)境樣品病毒含量時(shí)，除dPCR外，其余幾種方法檢測(cè)靈敏度極易受PCR抑制劑的影響[46]。病毒檢測(cè)前的富集過(guò)程致使大量PCR抑制劑同時(shí)被富集。PCR抑制劑可能造成樣品裂解，目標(biāo)核酸片段降解，并干擾目的基因擴(kuò)增[47]。例如，在進(jìn)行大體積水樣病毒檢測(cè)時(shí)，天然有機(jī)物的存在會(huì)降低PCR擴(kuò)增效率，導(dǎo)致95%加標(biāo)水樣中鼠諾如病毒的回收率不足10%[48]。因此，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加特定的病毒株設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)流程進(jìn)行質(zhì)量控制，包括病毒富集、核酸提取和PCR過(guò)程[49]。根據(jù)內(nèi)標(biāo)病毒株添加階段不同，實(shí)驗(yàn)對(duì)照包括全流程對(duì)照(樣品富集前加入內(nèi)標(biāo))、分子過(guò)程對(duì)照(核酸提取前加入內(nèi)標(biāo))和PCR對(duì)照(PCR前加入內(nèi)標(biāo))[49]。

3 基于高通量測(cè)序技術(shù)的病毒檢測(cè)方法

PCR檢測(cè)法局限于對(duì)單個(gè)或數(shù)個(gè)病毒的檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)病毒群落組成或病毒遺傳多樣性的全面檢測(cè)。近年來(lái)，迅猛發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因組技術(shù)，逐步取代以克隆文庫(kù)為代表的研究病毒遺傳多樣性的傳統(tǒng)方法[52]，為環(huán)境中病毒的高通量檢測(cè)和新型病毒的挖掘打開了一扇嶄新的大門[49,53]。

與細(xì)菌不同，病毒中不存在類似于16S rRNA基因片段的分子進(jìn)化標(biāo)志，無(wú)法使用特定的引物擴(kuò)增保守區(qū)域來(lái)研究病毒遺傳多樣性，必須對(duì)病毒全部基因片段進(jìn)行測(cè)序[54]。病毒宏基因組學(xué)，也被稱為宏病毒組學(xué)，是通過(guò)提取環(huán)境樣品中病毒的核酸(DNA或RNA)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)全部核酸片段進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)，主要包括病毒顆粒分離、核酸提取(DNA或RNA)、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA、核酸片段化和測(cè)序等流程[55]。在完成高通量測(cè)序后，如何從海量數(shù)據(jù)中識(shí)別病毒序列成為制約宏病毒組學(xué)技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序的生物信息學(xué)分析，研究者們開發(fā)出了一系列免費(fèi)的生物信息學(xué)軟件。但各軟件在病毒序列識(shí)別的原理、準(zhǔn)確性和對(duì)計(jì)算機(jī)性能的依賴存在較大的差異。目前常用的宏病毒組學(xué)中病毒序列識(shí)別生物信息學(xué)軟件見(jiàn)表1。

表1 宏病毒組學(xué)中病毒序列識(shí)別生物信息學(xué)軟件

宏病毒組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)療診斷、傳染病暴發(fā)和環(huán)境病毒的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。臨床診斷是目前宏病毒組應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域。病毒的臨床診斷通常依賴于嚴(yán)格的培養(yǎng)和診斷測(cè)試，而宏病毒組學(xué)技術(shù)可用于罕見(jiàn)病毒或新型病毒的快速鑒別。如2009年甲型流感(H1N1)暴發(fā)期間，高通量測(cè)序技術(shù)在新型流感病毒的鑒別和分型中發(fā)揮了重大作用[61]。在2019年底出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎疫情中，中國(guó)科學(xué)家于2020年1月11日即在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布新型冠狀病毒基因組序列，為后期疫情防控提供了重要依據(jù)[62]。

復(fù)雜環(huán)境中病毒的多樣性由于研究手段的限制一直被嚴(yán)重低估，基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏病毒組學(xué)技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，揭示了不同環(huán)境病毒豐富的多樣性。近年來(lái)，宏病毒組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境、土壤環(huán)境[63-66]、大氣環(huán)境[67]中病毒的檢測(cè)。其中，包括市政污水[68-69]、養(yǎng)殖廢水[70]、醫(yī)療廢水[71]、娛樂(lè)水體[72]、海水[73]在內(nèi)的水環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了多種已知和未知的病毒。

4 結(jié)語(yǔ)

準(zhǔn)確檢測(cè)水環(huán)境中病毒，是水環(huán)境生物安全保障的關(guān)鍵。目前，在病毒樣品制備的實(shí)際操作中，常采用多種富集方法相結(jié)合的策略，極大提高了富集效率。同時(shí)，PCR及其衍生技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)則為水環(huán)境中病毒快速、準(zhǔn)確和全面檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。但是，目前水環(huán)境病毒檢測(cè)方法仍存在一些問(wèn)題，主要包括：(1)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的病毒富集方法。不同研究者之間采用的富集方法各異，病毒的回收率存在較大差異，導(dǎo)致不同研究之間缺乏可比性；(2)由于病毒存在較高的基因突變，而基于PCR技術(shù)的病毒檢測(cè)方法依賴于準(zhǔn)確高效的引物和探針序列設(shè)計(jì)，導(dǎo)致參考已有研究的引物及探針序列可能會(huì)低估環(huán)境中病毒的豐度；(3)目前采用基于宏病毒組學(xué)技術(shù)檢測(cè)水環(huán)境病毒時(shí)，不同分析軟件結(jié)果之間存在較大差異，缺少統(tǒng)一的分析流程。針對(duì)以上問(wèn)題，亟須建立水環(huán)境中病毒富集的標(biāo)準(zhǔn)方法，這也有賴于相關(guān)部門出臺(tái)指導(dǎo)手冊(cè)或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。此外，針對(duì)病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，則應(yīng)進(jìn)一步完善并實(shí)時(shí)更新已知病毒的核酸序列信息，構(gòu)建更為全面、準(zhǔn)確的病毒數(shù)據(jù)庫(kù)，從而為水環(huán)境病毒檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化提供支撐。