楊靜園 阮孟斌 郭鑫 彭明

摘? 要：MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其部分成員在植物非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選到了多個(gè)木薯干旱脅迫相關(guān)的MYB類基因，本研究針對(duì)其中的1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子MeMYB2展開研究。MeMYB2蛋白N末端與AtMYB60蛋白的N末端氨基酸序列具有95%以上的相似度，但其C末端氨基酸序列與AtMYB60只有30%左右的相似度。編碼該蛋白的基因在木薯成熟葉片中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并且其表達(dá)受干旱脅迫負(fù)調(diào)控。MeMYB2蛋白主要定位于細(xì)胞核中，且在酵母中具有明顯的轉(zhuǎn)錄自激活活性，其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在蛋白C末端247～267位點(diǎn)之間的20個(gè)氨基酸殘基內(nèi)。利用酵母雙雜交系統(tǒng)從木薯cDNA文庫(kù)中篩選到了8個(gè)與MeMYB2互作的蛋白，其中的2個(gè)蛋白與氣孔運(yùn)動(dòng)和光合作用有關(guān)。MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯成熟葉片的失水率顯著低于野生型木薯成熟葉片，說(shuō)明MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控木薯葉片失水率，推測(cè)其可能具有調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)的功能。

關(guān)鍵詞：木薯;干旱脅迫;MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S533? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Characterization and Function Analysis of Cassava MYB Transcription Factor MeMYB2

YANG Jingyuan1， RUAN Mengbin2*， GUO Xin3， PENG Ming2

1. Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163000， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract： MYB transcription factor family is one of the largest transcription factor families in plants， playing key roles in stress response of many plants. Based on transcriptome data analysis， we have identified several drought-responsive MYB members from cassava （Manihot esculenta）. Herein， were perform characterization and function analyses on one of these drought-responsive MYB transcription factors， namely MeMYB2. MeMYB2 had 95% amino acid similarity with AtMYB60 in its N-terminus， whereas only 30% amino acid similarity was found in their C-terminus. MeMYB2 was specifically expressed in cassava leaves and was down-regulated by drought stress. Subcellular localization analysis indicated that MeMYB2 was localized in nucleus. Furthermore， MeMYB2 showed transcriptional activity in yeast， and the transcription activated domain was located within a 20 amino acid fragment between the 247-267AA position. Eight proteins were identified as the MeMYB2 binding protein according to the result of yeast two hybrid analysis. Two of these proteins are related to stomatal movement regulation and photosynthesis. The mature leaves of MeMYB2-RNAi transgenic cassava showed lower water loss rate than that of wild type， suggesting the roles of MeMYB2 in regulation of stomatal movement.

Keywords： cassava; drought stress; MeMYB2 transcription factor

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.004

木薯（Manihot esculenta）是三大薯類作物、六大糧食作物之一，主要生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是南亞熱帶地區(qū)廣泛種植的、用于加工淀粉和飼料的主要作物。隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，對(duì)木薯相關(guān)產(chǎn)品需求量不斷增加，木薯種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。然而，熱帶地區(qū)的間歇性干旱使木薯種植規(guī)模的擴(kuò)大受到了嚴(yán)重的限制。另外，作為一種典型的熱帶作物，對(duì)木薯響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)基因的研究不但可以挖掘木薯中的抗逆相關(guān)的功能基因，為木薯分子育種提供優(yōu)秀的基因資源，而且有助于了解植物響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制。

研究表明，植物在受到不同的非生物脅迫時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生相似的反應(yīng)，這意味著植物體內(nèi)有一些通用的途徑以響應(yīng)不同的非生物脅迫[1-2]。脅迫響應(yīng)機(jī)制的激活主要是與脅迫響應(yīng)有關(guān)的基因的表達(dá)調(diào)控，其中編碼調(diào)控保護(hù)基因表達(dá)的調(diào)控因子是表達(dá)調(diào)控中非常重要的一步，這類調(diào)控基因主要包括MYB、MYC、bZIP、bHLH、DREB2、AREB、NAC、WRKY類等轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥、水稻、小麥等植物中的研究表明，植物MYB基因受各種環(huán)境因子所誘導(dǎo)，如信號(hào)分子（ABA、SA、JA等）、病原體、干旱、低溫、創(chuàng)傷、高鹽脅迫等，在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。在逆境脅迫下，MYB蛋白與該元件的結(jié)合能夠激活或抑制下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而調(diào)控與脅迫響應(yīng)有關(guān)的級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和生理反應(yīng)。

MYB基因是植物中廣泛存在的一個(gè)功能多樣化的基因家族，根據(jù)MYB蛋白含MYB結(jié)構(gòu)域不完全重復(fù)子的個(gè)數(shù)，MYB基因可分為4類：1R、R2R3、3R、4R。綜合不同植物中的研究成果，MYB基因的功能可以劃分成幾大塊，主要集中在對(duì)以下幾個(gè)生理過(guò)程的調(diào)控方面：基本次生代謝、細(xì)胞命運(yùn)分化、發(fā)育過(guò)程以及響應(yīng)脅迫過(guò)程。Chen等[3]的研究表明擬南芥中的R2R3-MYB基因可能廣泛地參與了那些對(duì)調(diào)控植物逆境脅迫響應(yīng)有重要作用的激素應(yīng)答過(guò)程。擬南芥中有多個(gè)MYB基因通過(guò)ABA信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)葉片氣孔開閉，包括AtMYB60、AtMYB61、AtMYB15這3個(gè)R2R3-MYB基因[4-6]。另外，AtMYB44基因可以抑制ABI1/2、HAB1/2、AtPP2CA基因的表達(dá)，以此抑制ABA信號(hào)因子的產(chǎn)生，調(diào)控氣孔開閉，從而提高擬南芥對(duì)一些非生物脅迫的耐受性[7]。

植物在受到逆境脅迫后到對(duì)相應(yīng)的逆境有一定耐受性的過(guò)程中，除氣孔開閉調(diào)節(jié)外，相關(guān)代謝物的產(chǎn)生和累積也發(fā)揮著重要的作用。研究表明，MYB基因通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與到逆境脅迫相關(guān)代謝物的產(chǎn)生和累積過(guò)程中。在干旱條件下，AtMYB96基因通過(guò)調(diào)控?cái)M南芥長(zhǎng)鏈脂肪酸合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而調(diào)控表皮蠟質(zhì)的堆積，以提高植物對(duì)干旱的耐受性[8-9]。另外，AtMYB96可通過(guò)調(diào)控ABA與生長(zhǎng)素之間的信號(hào)耦合，促進(jìn)次生根的生長(zhǎng)[10]。AtMYB30基因同樣也可以調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，在響應(yīng)病原脅迫過(guò)程中激活超敏性細(xì)胞程序性死亡[11-12]。除此之外，AtMYB30還參與BR信號(hào)途徑，在擬南芥幼苗中調(diào)控下胚軸的伸長(zhǎng)[11， 13]。AtMYB41通過(guò)ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑響應(yīng)鹽及滲透壓脅迫，調(diào)控植物的一些基本代謝途徑，如糖、氨基酸代謝[14]。AtMYB2、AtMYB13、AtMYB33和AtMYB101參與了響應(yīng)非生物脅迫的ABA信號(hào)途徑[15-16]。

隨著木薯種植規(guī)模的擴(kuò)大，干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫對(duì)木薯產(chǎn)業(yè)的危害作用也越來(lái)越明顯。要應(yīng)對(duì)非生物脅迫的危害，首先必須了解木薯對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制。Sakurai等[17]對(duì)20 000個(gè)木薯全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行了測(cè)序分析并篩選了一些與脅迫響應(yīng)有關(guān)的基因家族;Lokko等[18]建立了一個(gè)富含干旱脅迫相關(guān)基因的EST庫(kù)，這些研究工作為木薯非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究提供了良好的數(shù)據(jù)支持。新技術(shù)特別是“組學(xué)”手段的應(yīng)用顯著加快了研究速度，同時(shí)也獲得了海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并構(gòu)建了大量脅迫信號(hào)相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[19]。木薯基因組的公布[20-21]為開展木薯非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)應(yīng)用“組學(xué)”手段，研究人員積累了大量木薯響應(yīng)干旱、低溫脅迫相關(guān)的“組學(xué)”數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、非編碼RNA等相關(guān)數(shù)據(jù)[22-24]，以及不同組織部位基因表達(dá)的數(shù)據(jù)[24-26]。隨后通過(guò)數(shù)據(jù)分析從中篩選出了大量脅迫相關(guān)基因，對(duì)其在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行了分析[23， 27-28]。

基因組數(shù)據(jù)及大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的發(fā)表為篩選木薯抗逆相關(guān)基因提供了便利，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，在木薯中篩選到多個(gè)與干旱脅迫相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因[26]。本研究分析了其中的1個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MeMYB2的特性和功能，并利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了部分與該轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白。為進(jìn)一步研究MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子的功能及其在木薯干旱脅迫響應(yīng)信號(hào)調(diào)控機(jī)制中的作用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

野生型煙草、木薯品種‘cv. 60444均由本實(shí)驗(yàn)室保存。將木薯‘cv. 60444成熟莖桿分成約30 cm的莖段，扦插于裝滿沙土的花盆中置于室外培養(yǎng)，萌發(fā)60 d后用作實(shí)驗(yàn)材料。MeMYB2- RNAi轉(zhuǎn)基因木薯由本實(shí)驗(yàn)室制備，具體材料見(jiàn)文獻(xiàn)[26]。

帶綠色熒光蛋白（eGFP）標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pG1300由本實(shí)驗(yàn)室改造并保存。酵母雙雜交系統(tǒng)采用Clontech Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System （cat#： 630489）。DNA測(cè)序和引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 干旱脅迫處理? 選擇葉片數(shù)為15～20片的木薯植株進(jìn)行干旱處理，以停止灌溉的方式進(jìn)行干旱處理，以最后一次灌溉后第4天（D0）為干旱處理起始時(shí)間點(diǎn)，連續(xù)處理12 d，處理過(guò)程中在不同的時(shí)間點(diǎn)，干旱0 d（D0）、2 d（D2）、4 d（D4）、8 d（D8）、12 d（D12）分別收集成熟葉片，以取自3個(gè)不同植株的混合樣品為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，至少收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品，液氮速凍后?70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 總RNA提取及cDNA的合成? RNA提取采用TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Plus Kit （cat#： DP441），按操作說(shuō)明書進(jìn)行提取。RNA的濃度和質(zhì)量以NanoDrop 2000（Thermo Scientific）系統(tǒng)進(jìn)行分析，濃度和質(zhì)量達(dá)到要求的RNA保存?zhèn)溆?。分別取1 g的總RNA為模板，按Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒（TaKaRa）的說(shuō)明書進(jìn)行操作，合成cDNA。

1.2.3? 基因表達(dá)分析? 以0.5 L cDNA產(chǎn)物作為PCR模板。采用Taq PCR MasterMix （code#： KT201-02）體系（TIANGEN）進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系及程序見(jiàn)說(shuō)明書，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35。熒光定量PCR采用SYBR? Premix Ex TaqTM II Kit （TaKaRa）試劑，在StepOneTM Real-Time PCR 儀器（Applied Biosystems）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算2???CT值對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，以木薯Actin基因的表達(dá)作為內(nèi)參。

1.2.4? MeMYB2基因cDNA全長(zhǎng)的克隆? 以葉片的cDNA為模板，采用TaKaRa公司的Ex Taq （code#： DRRR001A）酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min;然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，切下目的條帶，回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pLB零背景載體（TIANGEN，cat#：VT205）上，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5? MeMYB2蛋白亞細(xì)胞定位? 通過(guò)PCR在MeMYB2基因完整開放閱讀框兩端分別引入SalI和BamHI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在3端刪除MeMYB2基因編碼序列上的終止密碼，利用上述2個(gè)內(nèi)切酶將測(cè)序正確的MeMYB2基因序列插入pG1300植物表達(dá)載體，與標(biāo)記基因eGFP融合。構(gòu)建好的MeMYB2：pG1300經(jīng)測(cè)序鑒定正確后導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404備用。

通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)的方式對(duì)MeMYB2蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。以5 mL無(wú)針頭注射器將含MeMYB2：pG1300載體的農(nóng)桿菌菌液（OD600= 0.8～1.2）注射進(jìn)煙草葉片的下表皮，以攜帶pG1300空載體的農(nóng)桿菌作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（Olympus Fluo View FV1100）觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布。

1.2.6? MeMYB2在酵母中的轉(zhuǎn)錄自激活活性分析? 為研究MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子在酵母中的轉(zhuǎn)錄自激活活性，通過(guò)PCR在MeMYB2基因cDNA兩端分別引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在3端刪除MeMYB2基因編碼序列上的終止密碼，利用上述2個(gè)內(nèi)切酶將測(cè)序正確的MeMYB2基因全長(zhǎng)序列插入酵母表達(dá)載體pGBKT7的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建MeMYB2full：pGBKT7載體。對(duì)MeMYB2蛋白的C末端進(jìn)行缺失，通過(guò)PCR分別獲得了801 bp和741 bp兩個(gè)MeMYB2基因的3端缺失片段，同樣通過(guò)EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)插入pGBKT7的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建MeMYB2801：pGBKT7和MeMYB2741：pGBKT7。上述酵母表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序正確后按試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株，于SD/-Trp培養(yǎng)基上篩選，選取陽(yáng)性克隆備用。選取經(jīng)鑒定后的重組酵母菌株以0.9%的NaCl重懸后點(diǎn)在SD/-Trp/X- α-Gal培養(yǎng)基上，根據(jù)是否形成藍(lán)斑判斷MeMYB2缺失片段的轉(zhuǎn)錄自激活活性。

1.2.7? 酵母雙雜交篩選MeMYB2互作蛋白? 酵母雙雜交篩選方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。挑取含有MeMYB2760：pGBKT7質(zhì)粒的Y2HGold單菌落，接種于50 mL SD/Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)2～3 d，待其OD600為0.8左右時(shí)，于2 mL文庫(kù)菌液在2 L的錐形瓶中混合均勻，加入45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基，30 ℃搖床培養(yǎng)20 h，以顯微鏡觀察見(jiàn)“米老鼠”形狀時(shí)終止共培養(yǎng)。1500 r/min離心10 min后，用10 mL 0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸。取100 L 10?2、10?3、10?4的稀釋液涂于SD/-Trp、SD/-Leu、DDO（SD/-Trp/- Leu）固體平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。待平板上長(zhǎng)出菌落后，計(jì)算平板上克隆數(shù)量，計(jì)算滴度及雜交效率，將DDO/X（SD/-Trp/-Leu/AbA/ X-α-Gal）平板上所長(zhǎng)單菌落全部挑出，稀釋于無(wú)菌水中，點(diǎn)接在QDO/AbA/X（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α- Gal）板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取藍(lán)色的斑點(diǎn)在SD-Trp培養(yǎng)液搖菌，以pGADT7載體上的通用引物進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。將所篩選到的陽(yáng)性克隆在QDO/AbA/X-α-Gal平板上進(jìn)行二次培養(yǎng)，再次通過(guò)PCR鑒定篩選到陽(yáng)性克隆。

1.2.8? MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片水分蒸騰速率分析? 分別取MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯及野生型木薯成熟葉片各5片，分別對(duì)每片葉片稱重，隨后于室溫條件下置于培養(yǎng)皿中持續(xù)12 h，每隔2 h稱重一次，計(jì)算葉片失水率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 木薯MeMYB2屬于R2R3-MYB蛋白

通過(guò)蛋白序列的比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木薯MeMYB2屬于R2R3-MYB亞家族成員，2個(gè)DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域在其蛋白的N端（圖1A）。MeMYB2蛋白N末端的序列與AtMYB60具有

95%以上的相似度，但其C末端的序列與AtMYB60之間僅有不到30%的相似度（圖1B）。這意味著研究木薯MeMYB2基因的功能可在一定程度上參考AtMYB60相關(guān)的功能研究，但也需要注意木薯本身的特殊性。

2.2? MeMYB2基因在木薯成熟葉片中的表達(dá)受干旱脅迫負(fù)調(diào)控

多個(gè)植物MYB基因的表達(dá)都具有一定的組織特異性。根據(jù)木薯MeMYB2基因的序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異引物MeMYB2_PF和MeMYB2_PR（表1），以半定量PCR的方法對(duì)MeMYB2基因在野生型木薯‘cv.60444的葉片、葉柄、根的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MeMYB2基因在葉片和葉柄顯著表達(dá)，而在根部沒(méi)有表達(dá)（圖2A），說(shuō)明MeMYB2是1個(gè)葉片特異表達(dá)基因。與干旱處理起始時(shí)間點(diǎn)相比，干旱處理2 d后（D2），MeMYB2基因在葉片中的表達(dá)極顯著下降，隨著干旱時(shí)間的持續(xù)該基因的表達(dá)呈下降趨勢(shì)（圖2B）。以上結(jié)果表明干旱脅迫對(duì)MeMYB2基因在葉片中的表達(dá)具有明顯的負(fù)調(diào)控作用。

2.3? 木薯MeMYB2蛋白定位于細(xì)胞核中

植物中多數(shù)MYB類蛋白是作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，而轉(zhuǎn)錄因子蛋白在細(xì)胞核中起作用。以eGFP蛋白對(duì)MeMYB2蛋白進(jìn)行標(biāo)記形成MeMYB2-eGFP融合基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片的方法來(lái)瞬時(shí)表達(dá)MeMYB2-eGFP融合蛋白，以激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光的分布確定融合蛋白的亞細(xì)胞定位。同時(shí)，以擬南芥組蛋白Histone3與eGFP融合作為細(xì)胞核定位對(duì)照。觀察結(jié)果顯示（圖3），Histoen3-eGFP融合蛋白明顯富集于細(xì)胞核中，同樣MeMYB2- eGFP融合蛋白也主要分布在細(xì)胞核中，而未融合的eGFP蛋白可分布在整個(gè)細(xì)胞中，包括細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。以上結(jié)果表明MeMYB2蛋白可能是一個(gè)在細(xì)胞核中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子。

2.4? MeMYB2轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在其蛋白的C端247～267氨基酸殘基內(nèi)

轉(zhuǎn)錄因子蛋白的另一特性是具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活活性，可利用酵母菌種Y2HGold中的報(bào)告基因?qū)eMYB2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行分析。完整的MeMYB2蛋白（MeMYB2-full，含327個(gè)氨基酸殘基）以及C末端部分刪除蛋白MeMYB2- 267（含267個(gè)氨基酸殘基，刪除C末端60個(gè)氨基酸殘基）可明顯激活酵母Y2HGold中的報(bào)告基因MEL1的表達(dá)，從而在含X-α-Gal的培養(yǎng)基中顯示明顯的藍(lán)色（圖4）。而帶有另一個(gè)C末端部分刪除蛋白MeMYB2-247（含247個(gè)氨基酸殘基，刪除C末端80個(gè)氨基酸殘基）的重組Y2HGold酵母沒(méi)有形成藍(lán)色菌斑（圖4），說(shuō)明MeMYB2- 247未能激活MEL1基因的表達(dá)，在酵母中沒(méi)有轉(zhuǎn)錄自激活活性。上述結(jié)果表明MeMYB2蛋白具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活活性，且其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域處于蛋白C末端的247～267氨基酸殘基之間。

2.5? MeMYB2互作蛋白篩選

部分MYB類轉(zhuǎn)錄因子通常需要與其他蛋白互作進(jìn)行發(fā)揮其功能。以缺失蛋白MeMYB2-247為誘餌，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，從木薯葉片cDNA文庫(kù)中篩選到了多個(gè)與MeMYB2互作的蛋白（表2）。通過(guò)功能注釋發(fā)現(xiàn)其中的部分蛋白（Manes. 15G115100.1，Manes.05G142000.1）與氣孔開閉和光合效率有關(guān)，表明MeMYB2可能在木薯氣孔開閉以及葉片光合效率方面具有重要的調(diào)控功能。干旱脅迫對(duì)Manes.15G115100.1基因在葉片中的表達(dá)具有上調(diào)作用，但對(duì)Manes. 05G142000.1基因在葉片中的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用（圖5）。在正常生長(zhǎng)條件下，抑制MeMYB2基因的表達(dá)并不會(huì)明顯影響上述2個(gè)基因在木薯葉片中的表達(dá)（圖5）。但在干旱脅迫條件下，Manes.15G115100.1和Manes.05G142000.1基因在MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片中的表達(dá)量均明顯低于其在野生型木薯葉片中的表達(dá)（圖5）。

2.6? 抑制MeMYB2基因的表達(dá)可顯著降低轉(zhuǎn)基因木薯葉片的失水率

通過(guò)RNAi技術(shù)抑制MeMYB2的表達(dá)可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因木薯對(duì)干旱的耐受性顯著提高[26]。MeMYB2- RNAi轉(zhuǎn)基因木薯耐旱性的提高表明MeMYB2基因的表達(dá)可能與葉片水分蒸騰速率密切相關(guān)。在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯的成熟葉片與野生型木薯成熟葉片沒(méi)有明顯的差異（圖5A）。在葉片從植株取下12 h后，MeMYB2- RNAi轉(zhuǎn)基因木薯的成熟葉片沒(méi)有出現(xiàn)明顯的萎蔫現(xiàn)象，而野生型木薯成熟葉片明顯萎蔫卷曲（圖5B）。失水率統(tǒng)計(jì)結(jié)果同樣顯示，從葉片離體開始，MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯成熟葉片的失水率顯著低于野生型木薯成熟葉片（圖6C）。通過(guò)RT-PCR對(duì)MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯成熟葉片中MeMYB2基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因木薯中MeMYB2完整mRNA含量明顯比野生型低（圖6D），而用于基因干擾（RNAi）的RNA片段（491～933 bp）在轉(zhuǎn)基因木薯中的含量明顯高于野生型，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因木薯中MeMYB2的表達(dá)已被MeMYB2-RNAi明顯抑制。上述結(jié)果表明，MeMYB2基因的表達(dá)與木薯葉片的失水率直接相關(guān)。

3? 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一，木薯基因組中有319個(gè)MYB家族成員[26]。MYB類蛋白都有至少1個(gè)DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，聚類分析結(jié)果表明，木薯MeMYB2蛋白與擬南芥的AtMYB60蛋白在序列上相似度最高[26]。雖然在擬南芥以及其他一些作物中有較多的關(guān)于MYB類轉(zhuǎn)錄因子的研究，但有關(guān)木薯MYB類轉(zhuǎn)錄因子的研究極少?；谇捌诘霓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到部分干旱脅迫相關(guān)的MYB基因。在此基礎(chǔ)上，本研究著重對(duì)其中的1個(gè)成員MeMYB2的特性及功能展開研究。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子一般都具有至少1個(gè)DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，蛋白序列比對(duì)結(jié)果表明MeMYB2蛋白具有2個(gè)MYB保守結(jié)構(gòu)，其蛋白N末端與擬南芥AtMYB60具有非常高的相似度，但MeMYB2蛋白的C末端與AtMYB60蛋白的C末端的相似度極低。因此，AtMYB60的功能可為研究木薯MeMYB2的功能提供一定的參考。擬南芥突變體atmyb60對(duì)干旱脅迫的耐受性明顯比野生型高[4]。但是，在擬南芥中過(guò)表達(dá)MeMYB60基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性沒(méi)有明顯的影響。隨后，采用RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因木薯中抑制MeMYB2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯對(duì)干旱的耐受性明顯提高，這表明MeMYB2與AtMYB60一樣負(fù)調(diào)控植株的耐旱性。對(duì)MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片失水率的分析結(jié)果表明，抑制MeMYB2基因的表達(dá)可顯著降低轉(zhuǎn)基因木薯葉片的失水率，這意味著MeMYB2可能與AtMYB60一樣可以調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步的研究需要明確MeMYB2基因是否可以在木薯葉片保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄因子一般應(yīng)定位于細(xì)胞核中，且具有DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，MeMYB2蛋白主要分布于細(xì)胞核中且在酵母中具有明顯的轉(zhuǎn)錄自激活性。通過(guò)蛋白C末端缺失研究發(fā)現(xiàn)，MeMYB2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域處于其蛋白C末端序列第247～267之間的20個(gè)氨基酸殘基中。上述的結(jié)果表明MeMYB2是一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。利用酵母雙雜交系統(tǒng)，從木薯葉片cDNA文庫(kù)中篩選到8個(gè)可以與MeMYB2互作的蛋白。通過(guò)功能注釋發(fā)現(xiàn)其中Manes.15G115100.1是一個(gè)NPH3家族成員，該家族成員具有響應(yīng)光信號(hào)及調(diào)控氣孔開閉的功能[29]。而Manes.05G142000.1為質(zhì)體藍(lán)素（PetB），該蛋白在光合作用中起重要作用，這意味著MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子可能參與了對(duì)光合作用的調(diào)控，對(duì)MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯葉片光合效率的測(cè)定有助于進(jìn)一步了解該轉(zhuǎn)錄因子在木薯葉片光合作用過(guò)程中所扮演的角色。對(duì)MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子特性的研究及其功能的挖掘?qū)⒂兄谏钊肜斫庠撧D(zhuǎn)錄因子的功能，并為該轉(zhuǎn)錄因子在木薯遺傳育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰