張越亭 趙虎 劉永華

摘要 研究番茄葉片接種灰霉菌后番茄和病菌各自的轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)水平的變化規(guī)律，以闡明番茄和病菌各自的轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在發(fā)病中的可能作用。通過系統(tǒng)測定接種后0、12、36和60 h番茄和灰霉菌的轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種后葉片逐漸發(fā)病，60 h時出現(xiàn)明顯病斑。番茄葉片的CWIN基因LIN6表達(dá)水平在接種后12和60 h顯著高于對照葉片，CWIN抑制蛋白基因INVINH1表達(dá)水平在接種后12 h也顯著高于對照;番茄的2個STP基因SlSTP2和SlSTP1的表達(dá)水平分別在接種后12和60 h顯著高于對照葉片;此外，番茄的3個Clade Ⅲ SWEET基因SlSWEET10c、SlSWEET11a和SlSWEET11c在接種后12 h即顯著高于對照葉片?；颐咕廪D(zhuǎn)化酶基因Bc1g10247的表達(dá)水平在接種葉片后大幅上升，此外BcHXT1、BcHXT6、BcHXT13這3個己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平在接種后也呈大幅上升趨勢。總之，番茄CWIN和STP基因表達(dá)水平的上升并不能有效誘導(dǎo)抗病反應(yīng)并阻止灰霉菌吸收葉片中的糖分。相反，番茄Clade III SWEET表達(dá)的上升可能會導(dǎo)致蔗糖被大量轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外空間，而灰霉菌胞外轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的上升則可將細(xì)胞外蔗糖分解為己糖并吸收利用，最終導(dǎo)致灰霉病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞 灰霉病;番茄;蔗糖轉(zhuǎn)化酶;糖分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;基因表達(dá)

中圖分類號 S436.412.1+3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）10-0101-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Expression of Invertase and Sugar Transporter Genes in Both Tomato and Botrytis cinerea during the Development of Grey Mold

ZHANG Yue-ting，ZHAO Hu，LIU Yong-hua （College of Horticulture，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract The dynamic changes in the expression levels of invertase and sugar transporter genes in both tomato and pathogens during the development of grey mold on tomato leaves caused by Botrytis cinerea were studied to clarify the possible roles of invertase and sugar transporter of tomato and pathogens in the pathogenesis.The expression of invertase and sugar transporter genes of tomato and Botrytis cinerea at 0，12，36，and 60 h after inoculation were systematically measured.It was found that the leaves were gradually infected and showed obvious disease lesions at 60 h after inoculation.The expression level of CWIN gene LIN6 in tomato leaves was significantly higher than that of control leaves at 12 and 60 h after inoculation，and the expression level of CWIN inhibitory protein gene INVINH1 was also significantly higher than that of control at 12 h after inoculation;the expression levels of two STP genes SlSTP2 and SlSTP1 in tomato were significantly higher than those of control leaves at 12 and 60 h after inoculation，respectively.In addition，the three Clade III SWEET genes SlSWEET10c，SlSWEET11a and SlSWEET11c of tomato were also significantly higher than those of control leaves at 12 h after inoculation.The expression level of the extracellular invertase gene Bc1g10247 of Botrytis cinerea rose sharply after inoculating to tomato leaves.Additionally，the expression levels of three hexose transporters including BcHXT1，BcHXT6 and BcHXT13 also showed a significant increase after inoculation.In short，the induced expression of tomato CWIN and STP genes cannot effectively enhance defense responses and prevent gray mold from absorbing sugar in tomato leaves.On the contrary，the increased expression of Clade III SWEET in tomato leaves may cause a large amount of sucrose to be exported to the extracellular space of tomato leaves，which is subsequently hydrolyzed into hexose （glucose and fructose） and absorbed into the fungal cells by the induced extracellular invertase and hexose transporter in Botrytis cinerea，eventually leading to the incidence of grey mold.

Key words Botrytis cinerea;Tomato;Sucrose invertase;Sugar transporter;Gene expression

番茄（Solanum lycopersicum）原產(chǎn)于南美洲，屬于喜溫、喜光性一年生或多年生茄科草本植物[1]。番茄是重要的果菜類蔬菜，2018年全世界番茄產(chǎn)量高達(dá)1.82億t，其中我國番茄產(chǎn)量為0.62億t（FAO）。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一種世界性重要病害[2]。它主要危害番茄的果實(shí)，也會對花、莖、葉等部位產(chǎn)生危害，造成番茄減產(chǎn)，嚴(yán)重時甚至絕收[3]。

在植物對病菌的防衛(wèi)方應(yīng)中，蔗糖分解代謝發(fā)揮著重要作用[4-5]，一方面，蔗糖分解代謝可以為植物防衛(wèi)反應(yīng)提供碳骨架和能量。如細(xì)胞壁加厚、植物抗毒素（Phytoalexin）的合成以及抗病相關(guān)蛋白的積累等防衛(wèi)反應(yīng)都需要大量的糖分供應(yīng)[6]。另一方面，蔗糖分解產(chǎn)生的己糖（葡萄糖和果糖）也可以為病菌的生長提供能量和碳骨架[7]。在植物體內(nèi)有2種分解蔗糖的酶，分別是蔗糖合成酶（sucrose synthase，Sus）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（sucrose invertase，INV）。Sus可以將蔗糖分解為UDP-葡萄糖和果糖（該反應(yīng)可逆），是葉片光合作用產(chǎn)物蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶之一[8]。INV可以將蔗糖水解為葡萄糖和果糖（該反應(yīng)不可逆），在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著許多不同的功能，其中包括調(diào)節(jié)植物對病原菌的響應(yīng)[5]。在植物中，根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同可以將INV分為三類：細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar invertase，VIN）和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（cytoplasmic invertase，CIN）[9]。

目前有關(guān)蔗糖分解酶在植物抗病中的研究主要集中于CWIN。植物在受到病菌侵染的過程中其CWIN活性呈上升趨勢[10-11]。研究表明CWIN在植物抗病方面發(fā)揮著積極作用。如表達(dá)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)基因煙草對馬鈴薯Y病毒（potato virus Y）的抗性增加[12]。超表達(dá)CWIN基因的水稻可以增強(qiáng)對細(xì)菌性病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae和真菌性病菌Magnaporthe oryzae的抗性[13]。相反，抑制CWIN表達(dá)會降低植物的抗病性。如通過RNA干擾技術(shù)抑制煙草中CWIN的表達(dá)導(dǎo)致植株對卵菌病原菌Phytophthora nicotianae的抗性降低[10]。利用化學(xué)試劑Acarbose專一性抑制CWIN的活性導(dǎo)致擬南芥對細(xì)菌病菌Pseudomonas syringae pv.Tomato DC3000（Pst DC3000）的抗性下降[11]。然而，研究表明CWIN在一些植物的抗病中發(fā)揮著負(fù)面作用。如沉默番茄CWIN基因LIN8的表達(dá)增強(qiáng)了番茄對細(xì)菌性病菌Xanthomonas campestris pv.vesicatoria（Xcv）的抗性[14]。同樣，通過超表達(dá)CWIN抑制因子的方法降低CWIN的活性導(dǎo)致擬南芥對真菌病菌Plasmodiophora brassicae的抗性增加[15]。表明CWIN在植物抗病性中的作用可能受到植物和病菌種類的影響。

CWIN在質(zhì)外體空間將蔗糖分解為葡萄糖和果糖后，植物為了阻止病原菌對糖分的吸收上述己糖往往會上調(diào)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STP（Sugar TransPorter）的表達(dá)。STP主要位于植物細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外空間的己糖吸收進(jìn)入植物細(xì)胞，從而抑制病原菌的生長和繁殖[16-17]。如在擬南芥受到病菌侵染時，超表達(dá)AtSTP13可以增強(qiáng)其單糖攝取活性，與細(xì)菌競爭胞外糖，導(dǎo)致細(xì)菌無法得到能量來源，增強(qiáng)植物的抗病性[18]。相應(yīng)地，病原菌為了從植物獲得足夠的糖分用于自身的生長發(fā)育也進(jìn)化出了不同的對抗策略：一方面，病原菌誘導(dǎo)植物中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET（Sugars Will Eventually be Exported Transporter）的表達(dá)，SWEET可將植物細(xì)胞內(nèi)的糖分（蔗糖、葡萄糖和果糖）轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外部供病原菌吸收利用[19]。如白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）侵染水稻植株后分泌特定的轉(zhuǎn)錄激活（transcription Activator-Like，TAL）效應(yīng)因子，該效應(yīng)因子與OsSWEET11基因的啟動子特異原件結(jié)合，誘導(dǎo)OsSWEET11基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致更多糖分轉(zhuǎn)運(yùn)至水稻細(xì)胞外部，病菌獲得糖分，從而植株感病[20-22]。另一方面，大部分病原菌包括灰霉菌主要利用己糖（主要是葡萄糖）作為碳源，因此病原菌自身還表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可分解并吸收利用來自于植物的蔗糖[23]。如灰酶菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FRT1對果糖具有很高的特異性[24]，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族BcHXTs對己糖有很高的特異性[25]。此外，灰霉菌也向細(xì)胞外分泌轉(zhuǎn)化酶（如Bc1g10247和Bc1g16010）[26]。在灰霉菌侵染擬南芥時，該病菌的Bc1g10247基因表達(dá)增強(qiáng)[27]。目前大多數(shù)研究僅關(guān)注植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對植物抗病性的影響，很少研究病菌蔗糖轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對植物抗病性的影響，特別是尚未見有關(guān)番茄CWIN、STP和SWEET以及灰霉菌轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在番茄-灰霉菌互作過程中具體作用的研究。

筆者研究灰霉菌侵染番茄葉片過程中番茄葉片中CWIN、STP和SWEET相關(guān)基因表達(dá)水平的動態(tài)變化，同時也對灰霉病菌主要轉(zhuǎn)化酶基因和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)變化進(jìn)行研究，以期從番茄和灰霉菌兩方面初步闡明糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控灰霉病發(fā)病的可能機(jī)制，為后續(xù)高抗灰霉病番茄品種的選育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用的番茄（Lycopersicon esculentum）品種為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所育成的“新番2號”。挑選番茄種子并消毒，23 ℃恒溫催芽6 d。待種子發(fā)芽后，將已發(fā)芽的種子播種到穴盤內(nèi)。待子葉長出后，開始澆施稀釋后的日本園式營養(yǎng)液。栽培約20 d后，將4葉1心的番茄苗定植到海南大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地大田中進(jìn)行露地栽培，并施用一定量的復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）作為基肥。待番茄生長約30 d后，選取從植株頂端往下數(shù)第3～4葉位置的大小、形狀均勻一致且較為平整的葉片進(jìn)行灰霉菌離體接種。

1.2 方法

1.2.1 灰霉菌的培養(yǎng)和接種。灰霉菌（Botrytis cinerea）在V8培養(yǎng)基上，溫度為23 ℃的黑暗條件下進(jìn)行倒置培養(yǎng)，約14 d后灰霉菌產(chǎn)生大量分生孢子，可用于接種試驗(yàn)。番茄葉片離體接種灰霉菌的方法參照Lian等[28]并作一些調(diào)整。用SMB液體培養(yǎng)基先制備灰霉菌的孢子懸浮液，并調(diào)整孢子終濃度為2×104/mL。用蒸餾水將番茄葉片的表面清洗干凈，并用吸水紙吸干葉面的水，在直徑12 cm的塑料培養(yǎng)皿中倒入70 mL 0.8%的瓊脂，瓊脂冷卻凝固后將葉片的葉柄輕輕地嵌入瓊脂中并保持葉片上面平整。在每片葉子的主脈兩側(cè)各接種1滴孢子懸浮液，每滴5 μL，封口膜密封后，在23 ℃黑暗下培養(yǎng)。對照葉片則接種不含孢子的SMB液體培養(yǎng)基。分別于接種后0、12、36和60 h進(jìn)行觀察并取樣，取樣時以接種部位為中心取樣，稱取0.15 g樣品，液氮速凍后在-80 ℃保存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測定。每個處理均包含4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 灰霉菌生物量定量。

灰霉菌生物量測定方法參考Gachon等[29]，使用Tiangen植物DNA提取試劑盒DP305分別提取番茄葉片和灰霉菌的DNA，并用NanoDrop測定濃度和純度。使用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，在德國耶拿qTOWER3G上進(jìn)行qRT-PCR。具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。實(shí)時定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL DNA，5.0 μL SYBR Green I Master mix，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL，3.6 μL ddH2O。使用番茄葉片DNA和灰霉菌DNA梯度稀釋液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于對每個樣品中番茄和灰霉菌的DNA含量進(jìn)行定量測定。

使用Tiangen試劑盒DP305提取接種灰霉菌后的番茄葉片總DNA。使用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，在德國耶拿qTOWER3G上進(jìn)行qRT-PCR。具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL DNA，5.0 μL SYBR Green I Master mix，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL，3.6 μL ddH2O。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每個樣品中IGS和ACTIN的DNA量，用IGS/ACTIN表示灰霉菌的生物量，灰霉菌IGS引物參考Suarez等[30]，用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 引物設(shè)計。番茄的基因序列均從http：//www.sgn.cornell.edu網(wǎng)站獲取，灰霉菌的基因均從https：//www.broadinstitute.org網(wǎng)站獲取。使用Primer 5設(shè)計qRT-PCR引物，使用NCBI網(wǎng)站的Primer Blast 進(jìn)行引物特異性篩選，具體引物信息見表1。

1.2.4 植物和灰霉菌總RNA的提取。根據(jù)生工UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒的步驟提取植物和灰霉菌的總RNA，使用諾唯贊HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于番茄和灰霉菌的轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的分析。

1.2.5 植物和灰霉菌的基因表達(dá)。

使用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，在德國耶拿qTOWER3G上進(jìn)行。具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。實(shí)時定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL cDNA，5.0 μL SYBR Green I Master mix，10 μmol/L的正反向引物各0.2 μL，3.6 μL ddH2O。選擇用番茄ACTIN和灰霉菌BcTubA作為內(nèi)參基因，以上述cDNA為模板，對番茄和灰霉菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。以0 h 的W樣品對照，采用2-△△CT法對qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理 利用 Excel 2010軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)t-test分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后番茄葉片發(fā)病情況和灰霉菌生長情況 對接種后0、12、36、60 h的番茄葉片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在接種后0～12 h觀察不到病斑，接種后36 h在番茄葉片表面開始出現(xiàn)較小的病斑，而在接種后60 h則可觀察到明顯的病斑（圖1）。根據(jù)Gachon等[29]的方法，通過提取接種后番茄葉片的總DNA，利用qRT-PCR技術(shù)分別對灰霉菌IGS基因和番茄ACTIN基因進(jìn)行qRT-PCR測定，利用IGS/ACTIN來反映接種后葉片中灰霉菌的生長量，該比值越大表明番茄葉片中灰霉菌的生長量越高。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種12 h后番茄葉片中的灰霉菌生長量出現(xiàn)小幅上升，而36和60 h灰霉菌的生長量呈大幅增加的趨勢（圖2）。表明隨著番茄葉片病斑面積的增大，葉片中灰霉菌的生長量也逐漸增加。

2.2 接種灰霉菌后番茄葉片中CWIN及其抑制蛋白基因的表達(dá)分析

番茄基因組中共有4個編碼CWIN的基因，分別為LIN5、LIN6、LIN7、LIN8，其中在番茄葉片表達(dá)CWIN只有LIN6和LIN8，且LIN8的表達(dá)量顯著高于LIN6[31]。接種灰霉菌后，番茄葉片中主要的CWIN基因LIN8的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，且在接種后36 h達(dá)到峰值（圖3）。未接種灰霉菌的對照葉片中LIN8的表達(dá)量也呈相似的變化趨勢，且在4個時期內(nèi)未接種灰霉菌的對照葉片和接種灰霉菌的葉片之間均無顯著差異。接種葉片和對照葉片中的LIN6表達(dá)水平均呈先上升后下降再上升的趨勢;特別值得注意的是，與對照葉片相比，接種番茄葉片的LIN6表達(dá)水平在接種后12和60 h顯著升高，其表達(dá)水平分別為對照葉片的3和13倍。

植物中CWIN的活性不僅受到自身基因表達(dá)水平的影響，還受到CWIN抑制蛋白表達(dá)水平的調(diào)控，該抑制蛋白通過與CWIN蛋白結(jié)合的方式來抑制CWIN的活性[32]。對番茄葉片中CWIN抑制蛋白基因INVINH1表達(dá)水平的測定表明，接種葉片的INVINH1表達(dá)水平在接種后快速上升，而對照葉片中該基因的表達(dá)水平上升速度相對較慢，這導(dǎo)致在接種早期（12 h）接種葉片中的INVINH1表達(dá)水平顯著高于對照葉片（圖3）;然而在接種后36和60 h接種葉片和對照葉片在INVINH1表達(dá)水平上均無顯著差異。

2.3 接種灰霉菌后番茄葉片中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STP和SWEET基因的表達(dá)分析

番茄基因組中共有18個STP基因家族成員，分別為SlSTP1-18，其中僅有SlSTP1、SlSTP2和SlSTP12這3個家族成員在葉片中表達(dá)，且表達(dá)量依次為SlSTP12>SlSTP1>SlSTP2[33]。qRT-PCR測定結(jié)果表明，接種葉片中的SlSTP1表達(dá)量在接種后12和36 h與對照葉片無顯著差異，但在接種后60 h則顯著高于對照葉片，比對照高2倍左右（圖4）;接種葉片中的SlSTP2表達(dá)量在接種后12 h顯著高于對照葉片，較對照高4倍以上，但在接種后36和60 h與對照無顯著差異;和上述2個基因不同，接種葉片中的SlSTP12表達(dá)量在接種后12和60 h不但沒有高于對照葉片，反而顯著低于對照葉片，而在接種后36 h與對照葉片無顯著差異。上述結(jié)果表明灰霉菌接種會對STP相關(guān)基因的表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響，且不同STP成員對灰霉菌接種的響應(yīng)存在顯著差異。

植物的SWEET基因分為4類，其中專一性運(yùn)輸蔗糖的CladeⅢ SWEET和植物之間的抗病性關(guān)系最為密切[19]。番茄中有29個SWEET家族成員，其中屬于CladeⅢ的有13個，而在葉片中表達(dá)量較高的CladeⅢ基因有7個，分別為SlSWEET10a、SlSWEET10b、SlSWEET10c、SlSWEET11a、SlSWEET11c、SlSWEET12a、SlSWEET12c[33]。qRT-PCR測定結(jié)果表明，上述7個SWEET基因的表達(dá)對灰霉菌接種的反應(yīng)大致可以分為兩類，一類是接種灰霉菌后其表達(dá)量和對照葉片相比無顯著差異，包括SlSWEET10a、SlSWEET10b、SlSWEET12a、SlSWEET12c（圖5）;另一類是接種灰霉菌后其表達(dá)量和對照相比顯著升高，其中SlSWEET10c在接種后12 h相比對照分別上調(diào)了78%，SlSWEET11a在12和60 h相比對照分別上調(diào)了225%和267%;SlSWEET11c 在12和36 h相比對照分別上調(diào)了97%和126%;上述結(jié)果表明灰霉菌接種可能只是對部分SWEET基因的表達(dá)產(chǎn)生上調(diào)的影響，而這些SWEET可能在番茄抵御灰霉病侵染中發(fā)揮著重要作用。

2.4 接種番茄葉片后灰霉菌轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)分析

除測定番茄葉片中細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)外，還測定了接種后灰霉菌自身轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，灰霉菌可向細(xì)胞外分泌轉(zhuǎn)化酶，灰霉菌基因組中一個編碼胞外轉(zhuǎn)化酶的基因?yàn)锽c1g10247，其在灰霉病致病性中發(fā)揮著重要作用[27]。對Bc1g10247表達(dá)量的測定表明，接種番茄葉片后灰霉菌Bc1g10247表達(dá)量呈快速上升趨勢（圖6）。此外，灰霉菌基因組中有17個編碼己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其中BcHXT1、BcHXT6、BcHXT11、BcHXT13這4個己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白胨基因的表達(dá)豐度較高[27]。測定結(jié)果表明BcHXT1、BcHXT6、BcHXT13的表達(dá)水平在接種番茄葉片后均呈上升趨勢，特別是BcHXT1在接種后36 h即出現(xiàn)明顯的上升，表明這3個己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能在灰霉菌獲取糖分的過程中發(fā)揮著重要作用。BcHXT11的表達(dá)水平在接種番茄后呈下降趨勢。此外，灰霉菌中編碼果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因BcFRT1的表達(dá)水平在接種番茄葉片后也呈下降趨勢（圖6）。

3 討論

病原菌成功侵入植物細(xì)胞之前及其隨后在植物組織中的整個發(fā)育過程都需要從植物質(zhì)外體空間吸收糖分（主要是葡萄糖）來維持其生長發(fā)育[34-35]。因此，無論是植物還是病菌的蔗糖分解酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均會對植物-病菌的互作產(chǎn)生重要影響，從而影響病害的發(fā)生。然而，目前絕大部分有關(guān)糖代謝在植物抗病中的作用研究僅集中于研究植物蔗糖分解酶和糖分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，很少同時對病原菌的蔗糖分解酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行研究，該研究則同時研究番茄和灰霉菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。

研究表明，番茄葉片的CWIN活性在接種灰霉菌后12、24和48 h均顯著高于對照葉片[36]，但尚不清楚是哪個CWIN基因的表達(dá)在其中發(fā)揮主要作用，也不清楚CWIN抑制蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了何種變化。該研究對番茄CWIN基因LIN6和LIN8表達(dá)水平的測定表明，在番茄葉片中表達(dá)豐度最高的LIN8的表達(dá)水平在接種葉片和對照葉片之間無顯著差異，而LIN6的表達(dá)水平在接種后12和60 h葉片中的表達(dá)水平顯著高于對照葉片（圖3）。同時，接種葉片中的CWIN抑制蛋白基因INVINH1表達(dá)水平在接種后12 h顯著高于對照葉片（圖3）。上述結(jié)果表明，接種灰霉菌后番茄葉片中CWIN活性的升高主要是LIN6表達(dá)水平上升所導(dǎo)致的，而CWIN抑制蛋白基因INVINH1表達(dá)水平的升高并不能顯著抑制接種后番茄葉片CWIN活性的上升。

接種后番茄葉片CWIN活性的增加可通過將更多蔗糖分解為己糖（葡萄糖和果糖）從而導(dǎo)致質(zhì)外體空間中己糖/蔗糖比值的升高[36]。一方面，升高的己糖/蔗糖比值可誘導(dǎo)番茄的抗病反應(yīng)[16-17];但另一方面，增加的質(zhì)外體空間己糖也可為病菌生長發(fā)育提供更多的能量和碳骨架，從而促進(jìn)病害的發(fā)生[7]。植物的糖分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STP可將質(zhì)外體空間的糖分吸收進(jìn)入植物細(xì)胞從而可阻止病菌從葉片獲取糖分。對番茄葉片中表達(dá)的3個STP基因SlSTP1、SlSTP2和SlSTP12表達(dá)水平的測定表明，SlSTP1的表達(dá)量在接種后60 h顯著高于對照葉片，而SlSTP2表達(dá)量在接種后12 h顯著高于對照葉片。鑒于上述2個STP蛋白均位于植物細(xì)胞質(zhì)膜上[37]，推測其表達(dá)量的上升可通過將糖分吸收進(jìn)入葉片細(xì)胞從而抑制番茄灰霉病的發(fā)生。然而，伴隨著STP表達(dá)水平的變化，糖分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET的表達(dá)水平也發(fā)生了較大的變化。由于SWEET可將植物細(xì)胞內(nèi)的糖分（蔗糖、葡萄糖和果糖）轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外部供病原菌吸收利用，因此會促進(jìn)病菌對糖分的吸收利用[19]。對在番茄葉片中表達(dá)量較高的7個CladeIII SWEET基因表達(dá)水平進(jìn)行測定，結(jié)果表明有3個SWEET基因的表達(dá)水平受到灰霉病菌的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，分別是SlSWEET10c、SlSWEET11a和SlSWEET11c。上述結(jié)果表明，灰霉菌可能通過誘導(dǎo)番茄SWEET基因的表達(dá)來抵消STP表達(dá)增加的作用，從而能獲取足夠的糖分來成功侵染番茄。

除測定番茄葉片中細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)外，還測定了接種后灰霉菌自身轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)，接種番茄葉片后，灰霉菌胞外轉(zhuǎn)化酶基因Bc1g10247的表達(dá)水平呈持續(xù)增加的趨勢;此外，3個己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BcHXT1、BcHXT6、BcHXT13的表達(dá)水平在接種番茄葉片也大幅上升。上述結(jié)果表明，接種番茄葉片后胞外轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)水平的上升，將有利于灰霉菌將番茄葉片質(zhì)外體空間的蔗糖分解為己糖并吸收利用，從而有助于灰霉菌的成功侵染。

接種灰霉菌后，番茄葉片SWEET相關(guān)基因的表達(dá)水平受到灰霉菌的誘導(dǎo)而增加，糖分（主要是蔗糖）被SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)外體空間。同時，灰霉菌的胞外轉(zhuǎn)化酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量上升，從而可將番茄質(zhì)外體空間的蔗糖分解為己糖并吸收利用。雖然番茄葉片STP相關(guān)基因的表達(dá)量在接種灰霉菌后也大幅增加，但這并不能有效阻止灰霉菌對己糖的吸收利用，最終灰霉菌成功侵染番茄葉片。

參考文獻(xiàn)

[1]

程智慧.蔬菜栽培學(xué)各論[M].北京：科學(xué)出版社，2010：6.

[2] 陳利軍，郭世保，田雪亮，等.產(chǎn)香真菌GS-1菌株鑒定及其揮發(fā)性物質(zhì)對番茄灰霉病的生防效果[J].植物保護(hù)學(xué)報，2016，43（4）：608-613.

[3] 李保聚，朱國仁，趙奎華，等.番茄灰霉病在果實(shí)上的侵染部位及防治新技術(shù)[J].植物病理學(xué)報，1999，29（1）：63-67.

[4] KOCH K.Sucrose metabolism：Regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development[J].Current opinion in plant biology，2004，7（3）：235-246.

[5] RUAN Y L.Sucrose metabolism：Gateway to diverse carbon use and sugar signaling[J].Annual review of plant biology，2014，65（1）：33-67.

[6] BERGER S，SINHA A K，ROITSCH T.Plant physiology meets phytopathology：Plant primary metabolism and plant-pathogen interactions[J].Journal of experimental botany，2007，58（15/16）：4019-4026.

[7] RICO A，PRESTON G M.Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 uses constitutive-and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast[J].Molecular plant-microbe interactions，2008，21（2）：269-282.

[8] 李麗娜，孔建強(qiáng).植物蔗糖合酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2015，31（9）：904-913.

[9] STURM A.Invertases：Primary structures，functions，and roles in plant development and sucrose partitioning[J].Plant physiology，1999，121（1）：1-8.

[10] ESSMANN J，BONES P，WEIS E，et al.Leaf carbohydrate metabolism during defense[J].Plant signaling and behavior，2008，3（10）：885-887.

[11] BONFIG K B，GABLER A，SIMON U K，et al.Post-translational derepression of invertase activity in source leaves via down-regulation of invertase inhibitor expression is part of the plant defense response[J].Molecular plant，2010，3（6）：1037-1048.

[12] HERBERS K，MEUWLY P，F(xiàn)ROMMER W B，et al.Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase：Possible hexose sensing in the secretory pathway[J].Plant cell，1996，8（5）：793-803.

[13] SUN L，YANG D L，KONG Y，et al.Sugar homeostasis mediated by cell wall invertase GRAIN INCOMPLETE FILLING 1 （GIF1） plays a role in pre-existing and induced defence in rice[J].Molecular plant pathology，2014，15（2）：161-173.

[14] KOCAL N，SONNEWALD U，SONNEWALD S.Cell wall-bound invertase limits sucrose export and is involved in symptom development and inhibition of photosynthesis during compatible interaction between tomato and Xanthomonas campestris pv vesicatoria[J].Plant physiology，2008，148（3）：1523-1536.

[15] SIEMENS J，GONZLEZ M C，WOLF S，et al.Extracellular invertase is involved in the regulation of clubroot disease in Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant pathology，2011，12（3）：247-262.

[16] DOIDY J，GRACE E，KHN C，et al.Sugar transporters in plants and in their interactions with fungi[J].Trends in plant science，2012，17（7）：413-422.

[17] POMMERRENIG B，MDSAM C，KISCHKA D，et al.Treat and trick：Common regulation and manipulation of sugar transporters during sink establishment by the plant and the pathogen[J].Journal of experimental botany，2020，71（14）：3930-3940.

[18] LEMONNIER P，GAILLARD C，VEILLET F，et al.Expression of Arabidopsis sugar transport protein STP13 differentially affects glucose transport activity and basal resistance to Botrytis cinerea[J].Plant molecular biology，2014，85（4/5）：473-484.

[19] CHEN L Q，HOU B H，LALONDE S，et al.Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens[J].Nature，2010，468（7323）：527-532.

[20] CHU Z H，F(xiàn)U B Y，YANG H，et al.Targeting，xa13，a recessive gene for bacterial blight resistance in rice[J].Theoretical and applied genetics，2006，112（3）：455-461.

[21] YUAN M，CHU Z H，LI X H，et al.Pathogen-induced expressional loss of function is the key factor in race-specific bacterial resistance conferred by a recessive R gene xa13 in rice[J].Plant and cell physiology，2009，50（5）：947-955.

[22] YANG B，SUGIO A，WHITE F F.Os8N3 is a host disease-susceptibility gene for bacterial blight of rice[J].Proceedings of the national academy of sciences，2006，103 （27）：10503-10508.

[23] WILSON A M，WILKEN P M，VAN DER NEST M A，et al.Homothallism：An umbrella term for describing diverse sexual behaviours[J].IMA Fungus，2015，6（1）：207-214.

[24] DOEHLEMANN G，MOLITOR F，HAHN M.Molecular and functional characterization of a fructose specific transporter from the gray mold fungus Botrytis cinerea[J].Fungal genetics and biology，2005，42（7）：601-610.

[25] DULERMO T，RASCLE C，CHINNICI G，et al.Dynamic carbon transfer during pathogenesis of sunflower by the necrotrophic fungus Botrytis cinerea：From plant hexoses to mannitol[J].New phytologist，2009，183（4）：1149-1162.

[26] PARRENT J L，JAMES T Y，VASAITIS R，et al.Friend or foe？ Evolutionary history of glycoside hydrolase family 32 genes encoding for sucrolytic activity in fungi and its implications for plant-fungal symbioses[J].BMC Evolutionary Biology，2009，9：1-16.

[27] VEILLET F，GAILLARD C，COUTOS-THVENOT P，et al.Targeting the AtCWIN1 gene to explore the role of invertases in sucrose transport in roots and during Botrytis cinerea infection[J].Frontiers in plant science，2016，7：1-20.

[28] LIAN J J，HAN H Y，ZHAO J H，et al.In-vitro and in-planta Botrytis cinerea inoculation assays for tomato[J].The plant cell，2018，8（8）：e2810.

[29] GACHON C，SAINDRENAN P.Real-time PCR monitoring of fungal development in Arabidopsis thaliana infected by Alternaria brassicicola and Botrytis cinerea[J].Plant physiology and biochemistry，2004，42（5）：367-371.

[30] SUAREZ M B，WALSH K，BOONHAM N，et al.Development of real-time PCR （TaqMan） assays for the detection and quantification of Botrytis cinerea in planta[J].Plant physiology and biochemistry，2005，43（9）：890-899.

[31] FRIDMAN E，ZAMIR D.Functional divergence of a syntenic invertase gene family in tomato，potato，and Arabidopsis[J].Plant physiology，2003，131（2）：603-609.

[32] JIN Y，NI D A，RUAN Y L.Posttranslational elevation of cell wall invertase activity by silencing its inhibitor in tomato delays leaf senescence and increases seed weight and fruit hexose level[J].Plant cell，2009，21（7）：2072-2089.

[33] FENG C Y，HAN J X，HAN X X，et al.Genome-wide identification，phylogeny，and expression analysis of the SWEET gene family in tomato[J].Gene，2015，573（2）：261-272.

[34] NEHLS U，GHRINGER F，WITTULSKY S，et al.Fungal carbohydrate support in the ectomycorrhizal symbiosis：A review[J].Plant biology，2010，12（2）：292-301.

[35] FERNANDEZ J，MARROQUIN-GUZMAN M，WILSON R A.Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during fungal infections of leaves[J].Annual review of phytopathology，2014，52：155-174.

[36]

彭家麗，趙虎，李智佳，等.灰霉病對番茄葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性和可溶性糖含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（11）：156-160，163.

[37] REUSCHER S，AKIYAMA M，YASUDA T，et al.The sugar transporter inventory of tomato：Genome-wide identification and expression analysis[J].Plant and cell physiology，2014，55（6）：1123-1141.