劉 暢,崔敬愛,王思霽,于 婷,潘 佳,陳曉平

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)

隨著國民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,居民的生活品質(zhì)逐步提升,飲食方式和生活方式也發(fā)生改變。二十一世紀(jì)以來,糖尿病病人的年輕化情況越發(fā)嚴(yán)重,糖尿病腎病的發(fā)病人數(shù)已達(dá)到歷史最高[1]。大量臨床數(shù)據(jù)顯示,糖尿病腎病患者由Ⅰ型糖尿病繼發(fā)而成的占總數(shù)的30%～40%,而由Ⅱ型糖尿病演變而來的也有15%～20%之多,正因如此,糖尿病腎病成為終末期腎臟疾病的第2大病因,位居腎小球腎炎之后[2]。從國際糖尿病聯(lián)盟官方網(wǎng)站公布的數(shù)據(jù)來看,截止到2019年,我國共擁有1.164億糖尿病患者,約占全球糖尿病患者的25%,位居世界首位,據(jù)此可以預(yù)測,我國糖尿病腎病發(fā)病率仍將持續(xù)上升[3]。

近年來,大量科研結(jié)果發(fā)現(xiàn),高糖、高脂飲食以及生活作息紊亂會加速導(dǎo)致糖尿病病程的產(chǎn)生和發(fā)展,而糖尿病已成為糖尿病腎病的首要致病因素[4]。目前,糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制并未被明確,因此探究預(yù)防治療糖尿病腎病的藥物及其機(jī)制尤為重要[5]。臨床研究證實(shí),樺褐孔菌具有降低血糖、防治腫瘤增生、抗氧化、抵御病毒侵襲等功效[6],大量的國內(nèi)外專家以及科研學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),多糖類物質(zhì)是樺褐孔菌中的發(fā)揮主要作用的功能成分[7],它與加強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性、降低脂質(zhì)過氧化損傷有密切相關(guān)[8],但是有關(guān)于樺褐孔菌及其多糖對糖尿病腎病腎臟保護(hù)作用及作用機(jī)制方面的報(bào)道少之又少。

本文以高糖、高脂飼料和STZ(Streptozocin,STZ)聯(lián)合誘導(dǎo)法構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型,通過樺褐孔菌多糖(Inonotusobliquuspolysaccharide,IOP)對糖尿病腎病小鼠的基本生長狀態(tài)、腎功能的影響以及抗氧化指標(biāo)和腎臟病理的觀察等方面研究對樺褐孔菌多糖在糖尿病腎病的防治過程中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

100只SPF級身體健康、體態(tài)良好的雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量(18～22) g 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;野生樺褐孔菌 長春市藥材專柜;無水乙醇、氯仿、正丁醇、甲醛、生理鹽水 長春大洋化工有限公司;鏈脲佐菌素 美國Invitrogen公司;堿性蛋白酶滄州夏盛生物技術(shù)有限公司;鹽酸二甲雙胍片 南京億華藥業(yè)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒 索萊寶科技有限公司;尿八聯(lián)試紙 桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

電子天平(H01-B型) 北京和田興業(yè)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52CS型) 鞏義市予泰儀器設(shè)備有限公司;UV762型紫外可見分光光度計(jì) 上海精科儀器廠;ZL11-01型潔凈動物培養(yǎng)箱 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;BK-200型全自動生化分析儀 濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司;強(qiáng)生穩(wěn)擇易血糖儀及配套血糖試紙 強(qiáng)生(中國)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IOP的制備 野生樺褐孔菌經(jīng)冷凍干燥、打粉粉碎后,過0.425 mm篩,得到樺褐孔菌干粉。稱取1 kg野生樺褐孔菌干粉,加4倍蒸餾水,70 ℃水浴30 min,冷卻后經(jīng)紗布過濾,濾渣按料液比1∶2 g/mL加蒸餾水,100 ℃水浴30 min,紗布過濾,混合兩次濾液,10000 r/min、25 ℃離心15 min,70 ℃濃縮至800 mL,收集上清液,70 ℃濃縮至200 mL,加無水乙醇,讓乙醇在體系中的濃度達(dá)到80%,靜置24 h,離心取沉淀[9]。利用Sevage法,數(shù)次對沉淀脫蛋白,后靜置,冷凍干燥即得樺褐孔菌多糖[10]。經(jīng)多次試驗(yàn),以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,利用苯酚-硫酸比色法,計(jì)算得出:IOP的平均提取率為5.68%,多糖的純度為81%。

1.2.2 試驗(yàn)動物分組 100 只C57BL/6小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,動物飼養(yǎng)室環(huán)境整潔衛(wèi)生,濕度控制在40%～60%,室內(nèi)溫度控制在22～25 ℃,12 h明暗交替,飼養(yǎng)籠密閉但不密封、安全且無毒。隨機(jī)抽選10 只為對照組(CK),剩余小鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射STZ溶液,對照組注射同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,注射3 d后,測定空腹血糖,選擇血糖值大于15 mmol/L小鼠納入正式試驗(yàn)[11]。造模成功的小鼠中選取50 只,隨機(jī)分為模型組(CK1)、陽性對照組(CK2)、樺褐孔菌多糖低劑量組(Ⅰ)、中劑量組(Ⅱ)、高劑量組(Ⅲ),每組10只,對照組飼喂普通飼料,其余各組高糖高脂飼料喂養(yǎng),試驗(yàn)期間自由進(jìn)食、進(jìn)水,每天上午10點(diǎn)灌胃一次,連續(xù)灌胃4周后,頸椎脫臼處死小鼠進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

試驗(yàn)動物分組見表1。本試驗(yàn)獲得吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)協(xié)會許可,小鼠按照吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)。

表1 試驗(yàn)動物分組Table 1 Experimental animal grouping

1.2.3 指標(biāo)檢測

1.2.3.1 生長狀況監(jiān)測 每周測1次血糖、稱量1次小鼠體重,每天上午觀察小鼠一般生長狀態(tài),灌胃1次、更換1次墊料。

1.2.3.2 腎功能指標(biāo) 無菌環(huán)境下,將小鼠頸椎脫臼致死,用酒精球擦拭小鼠腹部,迅速用手術(shù)剪剪開小鼠腹腔,腹腔主動脈取血0.5 mL,3000 r/min離心5～10 min,分離出血清備用,試驗(yàn)結(jié)束后,按照血液分析儀操作規(guī)程,測定Scr、BUN和尿蛋白含量[12]。

1.2.3.3 腎臟指數(shù) 剪開小鼠腹腔,摘取雙腎,用生理鹽水沖洗粘連組織,濾紙吸干水分,用鑷子將雙腎筋膜剝離后稱取腎臟質(zhì)量,試驗(yàn)結(jié)束后,計(jì)算腎臟指數(shù)[13],另一部分腎臟組織保存于10%甲醛溶液中,用于腎臟組織病理學(xué)檢測。

1.2.3.4 腎臟抗氧化酶活力 剪取腎臟0.15 g,倒入生理鹽水1.5 mL,冰浴下充分研磨,勻漿,3000 r/min離心15 min,取上清液備用。試驗(yàn)結(jié)束后,嚴(yán)循試劑盒說明書,測定SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA的含量。

1.2.3.5 腎臟組織病理學(xué)檢測 試驗(yàn)結(jié)束后,將甲醛溶液固定好的腎臟組織標(biāo)本取出,經(jīng)流水沖洗,脫水,透明,浸蠟,包埋,切片后進(jìn)行HE染色,顯微鏡40倍物鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變[14]。

表2 IOP對小鼠體重的影響(g)Table 2 Effect of IOP on body weight of mice(g)

表3 各組小鼠生長情況Table 3 Growth state of mice in each group

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel(2019)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。應(yīng)用SPSS(20)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,組間t檢驗(yàn),組間差異有統(tǒng)計(jì)顯著性水平用P<0. 05表示,組間差異極顯著水平以P<0. 01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 IOP對小鼠體重影響

體重是衡量機(jī)體健康狀況的重要標(biāo)志之一,它能直觀的反應(yīng)出能量攝入與消耗之間的動態(tài)變化。對照組體重由于食用正常飼料,漲幅均為正常小鼠體重變化范圍內(nèi),而建模后,由于STZ摧毀體內(nèi)激素水平,加之高糖、高脂飼料喂養(yǎng),成模小鼠血糖均大幅上升且注射STZ各試驗(yàn)組體重與對照組呈現(xiàn)差異,說明糖尿病模型建造成功[15],結(jié)果如表2所示,建模后模型組小鼠體重與對照組相比增加7.0%,差異顯著(P<0. 05),試驗(yàn)4周后,模型組小鼠體質(zhì)量極顯著高于對照組，較其高17.6%(P<0.01)。相比較模型組,陽性對照組下降14.9%;各劑量組體重均呈下降趨勢,低、中、高劑量組體重分別下降13.4%、14.1%、17.4%。結(jié)果表明,樺褐孔菌多糖對糖尿病腎病小鼠體重的抑制效果顯著。

2.2 IOP對小鼠的生長情況影響

試驗(yàn)4周后(表3),對小鼠的一般特征進(jìn)行監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)對照組小鼠精神狀態(tài)較好,毛色黑亮,進(jìn)食、進(jìn)水正常,排尿正常,對外界刺激反應(yīng)靈敏,未發(fā)生死亡現(xiàn)象。模型組小鼠普遍狀態(tài)低迷,進(jìn)食、進(jìn)水、排尿均有所增加,對外界刺激反應(yīng)遲鈍。各給藥灌胃組的小鼠精神狀態(tài)逐漸改善,進(jìn)食水恢復(fù)正常,排尿也逐漸趨于正常,樺褐孔菌多糖高劑量組小鼠行動雖不及健康小鼠敏銳,但行動頻率和行動狀態(tài)都極佳。

2.3 IOP對小鼠腎臟的影響

2.3.1 IOP對小鼠腎臟指數(shù)的影響 糖尿病腎病模型的建立導(dǎo)致小鼠體內(nèi)激素分泌紊亂,使小鼠腎臟發(fā)生損傷和腫大[16]。灌胃4周后,陽性對照組和樺褐孔菌多糖高劑量的腎臟指數(shù)較模型組分別下降了14.9%和15.8%(P<0.01),樺褐孔菌多糖低、中劑量組較模型組腎臟指數(shù)分別降低了5.6%和6.2%(P<0.05),結(jié)果表明樺褐孔菌多糖對于小鼠腎臟指數(shù)的改善效果隨多糖濃度增加而增強(qiáng)。

表4 IOP對小鼠腎臟指數(shù)的影響Table 4 Effect of IOP on renal index of mice

2.3.2 IOP對小鼠腎臟功能的影響 肌酸在體內(nèi)代謝分解,其產(chǎn)物就是血肌酐,而蛋白質(zhì)在體內(nèi)分解代謝后的末產(chǎn)物即為尿素氮,臨床上將血肌酐、尿素氮作為腎衰竭的檢測項(xiàng)目,健康人的尿液檢查中是并不能檢出蛋白質(zhì)的存在,而一旦在尿常規(guī)中檢測出小分子蛋白,那么就可以判定該患者腎臟濾過功能不全,本試驗(yàn)對其檢測從而判斷糖尿病腎病小鼠腎功能情況[16],結(jié)果見表5,與對照組相比,模型組的Scr、BUN和尿蛋白含量均極顯著升高(P<0.01),這說明糖尿病腎病小鼠的腎功能從不同方面均表現(xiàn)出有損傷情況,經(jīng)過樺褐孔菌多糖干預(yù)4周后,各劑量組的Scr均較模型組相比有下降趨勢(P<0.05),且隨著濃度增加,下降幅度越大;而在樺褐孔菌多糖干預(yù)后,僅高劑量組BUN較模型組有顯著下降(P<0.05),其余各劑量組未見明顯差異;小鼠在接受樺褐孔菌多糖各劑量組干預(yù)后,尿蛋白含量均較模型組降低,且隨著濃度增加,尿蛋白含量呈遞減趨勢(P<0.01)。

表5 IOP對小鼠腎功能的影響Table 5 Effect of IOP on kidney function of mice

表6 IOP對小鼠抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effect of IOP on antioxidant indicators in mice

2.4 IOP對小鼠腎臟組織抗氧化能力的影響

高糖、高脂飼料喂食4周后,模型組小鼠腎組織SOD的含量比對照組下降32.3%(P<0.01,表6);模型組小鼠腎組織GSH-Px的含量較對照組下降30.8%(P<0.01);模型組小鼠腎組織CAT含量較對照組水平急劇下降,同比下降了41.8%(P<0.01),但在樺褐孔菌多糖干預(yù)4周后,各劑量組小鼠的SOD含量、GSH-Px含量、CAT含量均有所上升,且隨著濃度的增加也呈遞增趨勢,其中高劑量組SOD含量和GSH-Px含量較模型組分別上升了29.8%(P<0.01)和27.9%(P<0.01);CAT含量分別較模型組上升了10.2%、20.8%和23.8%(P<0.05)。高糖、高脂飼料喂食4周后,模型組小鼠腎組織MDA含量較對照組水平升高了50.7%(P<0.01),而樺褐孔菌多糖干預(yù)4周后,隨著濃度的增加,各劑量組小鼠的MDA含量分別較模型組下降了7.4%、11.4%和14.9%(P<0.05)。

2.5 IOP對小鼠腎臟組織病理學(xué)的觀察

為了更直觀的檢驗(yàn)糖尿病腎病小鼠的腎臟有損傷情況,驗(yàn)證樺褐孔菌多糖可以緩解糖尿病腎病小鼠腎臟損傷,我們將小鼠腎臟組織進(jìn)行HE染色[17],結(jié)果如圖1所示,對照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰,外形規(guī)則飽滿,血管充盈,腎間質(zhì)清晰,細(xì)胞核排列均勻且較為圓滿;模型組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)腎小球結(jié)構(gòu)不清晰,形狀不規(guī)則且分布不均勻,內(nèi)部浸潤著大量炎性細(xì)胞,腎間質(zhì)模糊,纖維化程度高,細(xì)胞核排列雜亂無章,且形狀多為橢圓形,細(xì)胞核多為空核;各樺褐孔菌多糖劑量組較模型組相比,腎臟結(jié)構(gòu)損傷有所改善,且高劑量組腎小球形狀有所緩解較為清晰,腎間質(zhì)纖維程度稍有緩解,細(xì)胞核也逐步恢復(fù)。

圖1 小鼠腎組織病理圖(HE染色)Fig.1 Mice renal hele pathology(HE staining)注:A:CK組;B:CK1組;C:CK2組;D:Ⅰ組;E:Ⅱ組;F:Ⅲ組。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)與高糖、高脂飼料飲食相結(jié)合構(gòu)建模型的方法,研究了樺褐孔菌多糖對糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用。結(jié)果表明,在高糖飼養(yǎng)的環(huán)境下,小鼠出現(xiàn)腎器官腫脹和腎功能損傷以及腎臟結(jié)構(gòu)損傷癥狀等癥狀,經(jīng)過樺褐孔菌多糖作用后,高劑量組小鼠的體重、腎臟腫大和生活狀態(tài)不佳有明顯的改善效果?？蓸O顯著降低糖尿病腎病小鼠的體重和腎臟指數(shù)(P<0.01),使小鼠體重下降,腎臟指數(shù)降低,小鼠精神狀態(tài)趨于正常。與模型組相比,高劑量組的樺褐孔菌多糖使小鼠血糖、Scr、BUN和尿蛋白水平下降,腎小球結(jié)構(gòu)混亂和模糊情況有所抑制。表明樺褐孔菌多糖有緩解腎臟結(jié)構(gòu)損傷、修復(fù)腎功能損傷的能力。

正常的機(jī)體情況下,自身完整的抗氧化酶系統(tǒng)可以保證機(jī)體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡,而氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化作用則表現(xiàn)為一種相失衡的狀態(tài)[18],機(jī)體內(nèi)的活性氧簇(ROS)增多或減少,都會造成分子、細(xì)胞等不同水平的機(jī)體損傷[19]]。但在正常機(jī)體反應(yīng)中,ROS的產(chǎn)生與消減是一種協(xié)調(diào)平衡,糖尿病患者血糖水平偏高,導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧自由基增加,但此時機(jī)體抗氧化系統(tǒng)削弱,大量的氧自由基存積[20]。SOD是生物體內(nèi)廣泛存在的一種抗氧化金屬酶,在機(jī)體抗氧化反應(yīng)中起到重要的作用[21],GSH-Px一般與SOD酶對機(jī)體過氧化損傷過程互相促進(jìn),起協(xié)同作用[22],而在腎臟的氧化還原過程中CAT起著至關(guān)重要的作用,它能幫助機(jī)體清除大量的自由基,防御細(xì)胞膜遭受損傷[23],MDA會引起體內(nèi)大分子化合物的交聯(lián)聚合,對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,可以通過機(jī)體內(nèi)丙二醛的含量可以推斷生物膜的過氧化程度,間接反映出機(jī)體受自由基的損傷程度。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,樺褐孔菌多糖能夠顯著改善糖尿病腎病小鼠的抗氧化能力減弱癥狀(P<0.01)。模型組小鼠腎組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、CAT、GSH-Px活力均下降,而在樺褐孔菌多糖各劑量組灌胃4周后,小鼠腎組織的抗氧化酶活力系統(tǒng)中SOD、CAT、GSH-Px活力極顯著(P<0.05)上升,MDA含量較模型組顯著下降,因此,可以初步判斷樺褐孔菌多糖對糖尿病腎病的保護(hù)與抗氧化損傷有關(guān)。樺褐孔菌多糖高劑量組的效果最為明顯,雖與正常水平仍存在一定距離,但總體分析可以看出,樺褐孔菌多糖的確有增強(qiáng)小鼠抵抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的能力,有效抑制機(jī)體過氧化和脂質(zhì)過氧化,從而抑制了糖尿病腎病的進(jìn)一步進(jìn)展。

綜上所述,樺褐孔菌多糖能夠改善小鼠腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)程,保護(hù)腎臟組織的損傷和腫大情況,緩解腎臟組織的病理學(xué)改變,修復(fù)了因炎癥造成的腎小球形變和細(xì)胞核空核等癥狀,緩解尿糖尿蛋白現(xiàn)象,從而增強(qiáng)和改善腎功能。此外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖高劑量組對糖尿病腎病有明顯的抑制效果,但導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生還有很多途徑,發(fā)病機(jī)理也各不相同,因此需要進(jìn)行進(jìn)一步探究,多方面破解糖尿病腎病這個難題。