多藥同服對(duì)大鼠回腸P-糖蛋白的影響

苑 鍵，萬(wàn) 軍

世界衛(wèi)生組織將多藥同服定義為“同時(shí)服用多種藥物或過(guò)量服用藥物”[1]。即使在許多情況下是由于伴隨的疾病或者復(fù)雜的治療情況會(huì)使用更多的藥物，多藥同服與多發(fā)共病的存在與藥物-藥物或藥物-疾病的相互作用呈現(xiàn)高概率相關(guān)[2]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，許多口服藥物生物利用度低的主要原因與存在于腸黏膜的P-糖蛋白(P-gp)有關(guān)，P-gp作為一種能量依賴(lài)性藥物外排泵，通過(guò)ATP供能，將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度[3]。P-gp的這種作用被認(rèn)為是導(dǎo)致口服藥物生物利用度降低的主要原因。同時(shí)，在胃腸道中P-gp活性和功能的定量數(shù)據(jù)目前還不清楚[4]。

垂直擴(kuò)散池(ussing chamber)是研究胃腸道屏障功能的金標(biāo)準(zhǔn)。能夠模擬腸道的生理環(huán)境并對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的不同階段進(jìn)行研究。根據(jù)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，我院患者同時(shí)服用抗血小板聚集藥物、抗抑郁藥物、抑酸藥、降糖藥的占很大比重，因此選擇了氫氯吡格雷、雷貝拉唑、草酸艾斯西酞普蘭、甲苯磺丁脲這四種藥物進(jìn)行多藥同服的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

本研究使用大鼠離體回腸段，通過(guò)ussing chamber轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究多藥同服對(duì)P-gp底物羅丹明123(R123)的影響，以及非P-gp底物熒光素鈉(CF)的轉(zhuǎn)運(yùn)行為，研究目標(biāo)藥物與腸道內(nèi)P-gp交互作用，以了解多藥同服與單藥應(yīng)用在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)層面是否存在差異，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Ussing chamber(北京金工鴻泰)，熒光測(cè)定儀F-2000(日本東京HITACHI株式會(huì)社)，羅丹明123、熒光素鈉、戊巴比妥鈉(Sigma公司)，硫酸氫氯吡格雷標(biāo)準(zhǔn)品、雷貝拉唑鈉標(biāo)準(zhǔn)品、草酸艾司西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)品、甲苯磺丁脲標(biāo)準(zhǔn)品、維拉帕米標(biāo)準(zhǔn)品(solarbio公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組方法與動(dòng)物模型制備 40只大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)，分別為：空白對(duì)照組(生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(維拉帕米)，單藥組(氯吡格雷),多藥組(氯吡格雷+雷貝拉唑+草酸艾司西酞普蘭+甲苯磺丁脲)，每組分別進(jìn)行吸收試驗(yàn)(n=5)和分泌試驗(yàn)(n=5)。藥物劑量分別為：生理鹽水 2 ml/只；氯吡格雷 30 mg/kg，維拉帕米 20 mg/kg，草酸艾司西酞普蘭 20 mg/kg，雷貝拉唑 20 mg/kg，甲苯磺丁脲 500 mg/kg。上述藥物均用生理鹽水配制，每只大鼠每日灌胃1次，溶液劑量為2 ml。灌胃7 d后每組分別調(diào)查羅丹明123和熒光素鈉的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)。

1.2.2 Ussing chamber實(shí)驗(yàn) Wistar雌性大鼠(北京維通利華)，8周齡，(230±20) g。實(shí)驗(yàn)大鼠給予樣品1周后, 禁食16～18 h, 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉, 延腹中線將腹部切開(kāi)2.5 cm左右, 胃下5 cm處為空腸(空腸約10 cm), 在空腸前端插入硅膠管(內(nèi)徑2 mm)結(jié)扎, 空腸末端剪開(kāi)一小口后, 輕緩地用生理鹽水沖洗腸段2次、通入空氣4次, 分離回腸置Krebs-Ringer緩沖液中, 冰浴培養(yǎng)5 min，剪取3～4 cm長(zhǎng)的腸段, 迅速分離除去筋膜層, 將腸黏膜固定于擴(kuò)散池上。吸收方向時(shí)(M-S),在黏膜側(cè)加入5 ml R123溶液或CF溶液, 漿膜側(cè)加入5 ml Krebs-Ringer緩沖液；分泌方向?qū)嶒?yàn)時(shí)(S-M),漿膜側(cè)加入5 ml的R123溶液或CF溶液,黏膜側(cè)加入5 ml Krebs-Ringer緩沖液。在混合氣體(95% O2/5% CO2)的作用以及37.5 ℃水浴保溫下, 分別于15、30、45、60、75、90和120 min在接收側(cè)取樣0.5 ml, 同時(shí)補(bǔ)充0.5 ml 37.5 ℃ Krebs-Ringer緩沖液。各份取樣后的樣品于冰箱中保存直到進(jìn)行熒光分析。

1.2.3 羅丹明123和熒光素鈉的方法學(xué)考察 羅丹明123的激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm，可在此波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，空白無(wú)干擾。羅丹明123在10～200 μg/L，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，Y=0.2238X+2.5657,線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R2=0.9978)，回收率和日內(nèi)精密度分別為99.8%和0.8%。

熒光素鈉的激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，可在此波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，空白無(wú)干擾。熒光素鈉在200～2000 μg/L，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，Y=0.6373X+0.0699，線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R2=0.9987)，回收率和日內(nèi)精密度分別為99%和2.6%。

1.2.4 累計(jì)滲透量及表觀滲透系數(shù)的測(cè)定 將熒光分析法測(cè)定的每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)處理, 得到給定時(shí)間漿膜側(cè)(吸收方向)藥物質(zhì)量濃度ρtn1和黏膜側(cè)(分泌方向)藥物質(zhì)量濃度ρtn2 , 用公式Qtn =Σ0.5ρt(n-1)+5ρtn計(jì)算累計(jì)透過(guò)量(Qtn), 其中0.5和5表示取樣體積和加入藥液量,分別為0.5和5 ml。根據(jù)給藥劑量D，計(jì)算累計(jì)透過(guò)百分率(Qtn/D×100%)。另外,表觀滲透系數(shù)(Papp)是表示藥物經(jīng)黏膜透過(guò)能力的重要指標(biāo), 其計(jì)算公式為: Papp=(dQ/dt)×(1/Aρ0 ), 單位cm/s, 其中dQ/dt表示穩(wěn)態(tài)時(shí)時(shí)間-累計(jì)透過(guò)量線性回歸所得的斜率，A為有效滲透面積(1.78 cm2)，ρ0為加入藥液側(cè)初始藥物質(zhì)量濃度。在本實(shí)驗(yàn)中, 泵出比(efflux ratios, ER)用于評(píng)價(jià)對(duì)P-gp的抑制作用效果, 其計(jì)算公式為ER=PappSM /PappMS, 其中PappSM是分泌方向的平均滲透系數(shù), PappMS是吸收方向的平均滲透系數(shù)，其中SM為分泌方向(漿膜側(cè)到黏膜側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn))；MS為吸收方向(黏膜側(cè)到漿膜側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn))。

2 結(jié) 果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)R123經(jīng)回腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp的影響 (1)吸收方向：R123經(jīng)大鼠回腸黏膜吸收方向的經(jīng)時(shí)曲線，陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，透過(guò)率有顯著增高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單藥組、多藥組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雖然多藥組對(duì)R123在吸收方向較單藥組有增加趨勢(shì)，但是兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。陽(yáng)性對(duì)照組Papp與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，單藥組Papp與多藥組相比有增高趨勢(shì)，但兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。(2)分泌方向：R123經(jīng)大鼠回腸黏膜分泌方向的經(jīng)時(shí)曲線，陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，透過(guò)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，多藥組和單藥組相比，透過(guò)率有顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單藥組、多藥組與空白對(duì)照組透過(guò)率相比無(wú)顯著性差異(圖1)。陽(yáng)性對(duì)照組Papp與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)，多藥組Papp較單藥組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。(3)ER：空白對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)，單藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)，多藥組與單藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，多藥組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05，表1)。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)羅丹明123對(duì)大鼠回腸黏膜Papp的影響

圖1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)羅丹明123經(jīng)大鼠回腸黏膜吸收方向透過(guò)和分泌方向透過(guò)的經(jīng)時(shí)效益

2.2 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)熒光素鈉經(jīng)回腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp的影響 (1)吸收方向：CF經(jīng)大鼠回腸黏膜吸收方向的經(jīng)時(shí)曲線，單藥組、多藥組分別與空白對(duì)照組相比，透過(guò)率有顯著降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然多藥組在吸收方向較單藥組相比有增高趨勢(shì)，但兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)；多藥組Papp和單藥組Papp相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。(2)分泌方向：空白對(duì)照組與其余各組間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)，各組ER相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)CF經(jīng)大鼠空腸黏膜吸收方向透過(guò)和分泌方向透過(guò)的經(jīng)時(shí)效益

表2 不同實(shí)驗(yàn)組CF對(duì)大鼠回腸黏膜Papp的影響

3 討 論

影響藥物吸收的主要屏障可概括為化學(xué)屏障、物理屏障和生化屏障三大類(lèi)[5]。腸上皮細(xì)胞的代謝酶和藥物外排泵構(gòu)成是生化屏障的重要部分。代謝酶主要通過(guò)體循環(huán)前代謝將已進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的相應(yīng)藥物代謝，喪失其活性。藥物外排泵系統(tǒng)主要通過(guò)P-gp、MRP、MTX等外排系統(tǒng)[6，7]，將腸道細(xì)胞內(nèi)已吸收的藥物“泵”回腸腔，從而降低腸道細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致口服藥物生物利用度減弱[8]。

本研究分別給大鼠灌胃藥物1周后，觀察4個(gè)實(shí)驗(yàn)組在120 min內(nèi)R123經(jīng)大鼠回腸的經(jīng)時(shí)透過(guò)量。研究中發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組分泌方向透過(guò)的經(jīng)時(shí)曲線與吸收方向相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，驗(yàn)證了R123是P-gp的底物，而維拉帕米(陽(yáng)性對(duì)照組)逆轉(zhuǎn)了這種作用，同時(shí)驗(yàn)證了維拉帕米是P-gp的抑制藥。單藥組R123的轉(zhuǎn)運(yùn)方向由分泌為主變?yōu)槲諡橹鳎f(shuō)明氯吡格雷可以抑制P-gp的功能(空白對(duì)照組ER=6.18±3.57vs.單藥組ER=0.65±0.31，P<0.05)。多藥組吸收方向累計(jì)透過(guò)率與單藥組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而分泌方向的Papp有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(單藥組Papp=0.86±0.18vs.多藥組Papp=11.42±4.38)，同時(shí)兩者ER相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(單藥組ER=0.65±0.31vs.多藥組ER=12.27±4.74)。說(shuō)明藥物在空腸黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，氫氯吡格雷可以抑制P-gp的功能，減少藥物的分泌，而多藥組會(huì)減輕這種抑制作用，使藥物外排量增加，減少了藥物的吸收量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多藥組ER與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(多藥組ER=12.27±4.74vs.空白對(duì)照組 ER=6.18±3.57)，可能由于藥物種類(lèi)的增加增強(qiáng)了P-gp的功能，也可能由于P-gp的外排作用使多藥在腸道中停留時(shí)間增加，產(chǎn)生了毒性物質(zhì)所導(dǎo)致。

除了空白對(duì)照組使CF在吸收方向和分泌方向透過(guò)增加，其余藥物均使CF的透過(guò)顯著降低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)藥物均為載體吸收而非細(xì)胞旁路途徑吸收。有研究表明，通過(guò)可逆性調(diào)節(jié)緊密連接孔徑促進(jìn)吸收的藥物則毒性較小，這類(lèi)物質(zhì)曾經(jīng)作為藥物輔料添加在口服制劑中，然而腸上皮細(xì)胞膜暫時(shí)開(kāi)放所引起的有害物質(zhì)的吸收，仍是一個(gè)無(wú)法回避的安全隱患問(wèn)題[9]。而本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，不論從吸收方向還是分泌方向，維拉帕米組、單藥組和多藥組的累計(jì)透過(guò)率和Papp均低于空白對(duì)照組。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷可以抑制回腸P-gp的功能，但是多藥同時(shí)服用會(huì)明顯減弱氯吡格雷的這種抑制作用。因此，在共病治療或者綜合性治療時(shí)，盡量避免多種藥物同時(shí)服用，防止出現(xiàn)口服藥物生物利用度降低，減弱藥效，從而導(dǎo)致治療失敗。