涂仕娟,陳 鵬,楊紅亞*

(1.成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學與生命科學學院,成都 611137)

針灸作為中醫(yī)學體系里的獨特分支,除秉承中醫(yī)整體調(diào)節(jié)和辨證論治的優(yōu)勢外,更具備操作簡便、起效迅速、物理刺激不良反應小等特點[1],隨之而來的針灸療效機制研究是目前中醫(yī)學研究的熱點之一。 動物模型為針灸療效機制研究提供了良好的載體,大鼠是針灸機制研究中最常用的動物之一。 但是目前對大鼠針灸實驗固定方法的研究較少,常用的固定方法有束縛法[2]、束袋法[3]、鼠筒法[2,4]、輸液瓶固定法[5]、置高臺法[6]等。 課題組在進行膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)模型大鼠溫針灸治療時曾嘗試這些固定方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類方法存在大鼠應激反應強烈、取穴部位受限、掉針、僅適合特定部位單純針刺,不適用于針灸治療、固定器型號只適用于限定體重動物等局限性。 因此,選擇一種操作簡便,又能減少針灸治療中動物應激反應的固定方法,是針灸機制研究中面臨的一個關鍵問題。

如何減少大鼠固定和治療過程的應激反應呢?筆者聯(lián)想到蕩秋千時雙腿懸空、足部無著力點、下肢無法發(fā)力的體驗,受此啟發(fā),反復實踐后設計了一種大鼠溫針灸的“鼠衣秋千式”固定方法,以KOA模型大鼠為實驗對象,觀察固定及治療過程動物的應激反應,并評估該方法的適用范圍,同時與溫針灸治療中常用的束縛法進行對比。 結(jié)果顯示,“鼠衣秋千式”固定法中的大鼠在固定及溫針灸治療過程中應激反應較小,四肢部位穴位充分暴露,1 名實驗人員即可獨立完成對大鼠的固定和治療,操作簡便。 現(xiàn)將“鼠衣秋千式”固定裝置的制作及使用方法介紹如下,供各位同仁參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 60 只,體重(250±20) g,7周齡,來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學科研創(chuàng)新中心屏障環(huán)境動物房[SYXK(川)2020-124]。 本實驗通過成都中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查(2019-14),并嚴格按照動物使用的減少、優(yōu)化、替代“3R”原則進行設計。

1.2 主要試劑與儀器

廢棄的白大褂(或舊衣料),剪刀,縫衣針,縫衣線,3 mm×400 mm 的自鎖式塑料尼龍扎帶,長3 m、寬15 cm 布帶條1 根,S 形小號掛鉤若干,50 mm 規(guī)格的長尾夾,小號鑷子,帆布手套,乳膠手套(海門市揚子醫(yī)療器械有限公司);1 mL 一次性無菌注射器(成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司);0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司);碘乙酸鈉(MIA)(美國 Sigma-Aldrich 公司);寵物電推剪(型號:RFCZ-572,九江亨利電器有限公司);0.25 mm×25 mm 華佗牌一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);1.2 cm×1.5 cm 的小艾炷(湖南省高圣生物有限公司);碘酒(四川金山制藥有限公司);75%乙醇(山東安捷高科消毒科技有限公司),硬紙板,打火機,艾灰盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

大鼠適應性喂養(yǎng)2 周后,選取體重(400±20) g的大鼠采用碘乙酸鈉(MIA)膝關節(jié)腔注射的方法復制KOA 模型[7-9],關節(jié)腔注射同等體積無菌生理鹽水的大鼠設置為空白組。 飼養(yǎng)環(huán)境日光燈12 h 明暗更替照明,安靜且通風,溫度(23±2)℃,相對濕度50%～70%,大鼠自由攝食飲水。

1.3.2 固定裝置制作及使用方法

(1)制作方法

將清潔后的舊白大褂衣料縫制成攤開尺寸為50 cm×13 cm 的筒狀鼠衣,用剪刀在上面分別開2個φ2.5 cm 和φ3.5 cm 的孔,用以掏出大鼠的前后肢,大小兩孔之間距離為17 cm,見圖1。

(2)使用方法

造模2 周后,篩選復制成功的KOA 大鼠模型進行溫針灸治療[10-12],其中20 只大鼠采用常規(guī)的束縛法固定,20 只大鼠采用“鼠衣秋千式”固定。 每只大鼠溫針灸治療每日1 次,5 次為1 個療程,共2 個療程,療程間間隔2 d。

①鼠衣固定

操作者戴好手套,將大鼠置于粗糙的臺面上,左手抓住鼠尾向后輕拉,右手將鼠衣的一端口打開,利用大鼠喜暗喜鉆洞的習性,將其置于鼠衣口處,大鼠會自行鉆入其中,見圖2。 當大鼠鉆到鼠衣中間時,頭部則完全被鼠衣覆蓋。 左手隔著鼠衣迅速握住大鼠軀干,找到上肢與軀干連接處,拇食中三指從腹部方向夾持住大鼠兩側(cè)的肩胛骨,右手掏出大鼠的兩前肢。 在左手掌心與大鼠的軀干間留出縫隙,將尼龍扎帶從縫隙中穿過,圍繞鼠衣一周將大鼠前端固定,見圖3。 最后采用相似的方法固定大鼠身體后端,使其雙側(cè)后肢位于鼠衣外面。 完成上述操作后,觀察大鼠是否出現(xiàn)張口呼吸、反應劇烈等情況,根據(jù)動物反應調(diào)整尼龍扎帶束縛的松緊。 針灸組大鼠體型體重相似,測量束縛大鼠所用尼龍扎帶圍繞身體前端及后端一周所需的長度,并用記號筆對新扎帶做標記,有助于快速有效地固定下一只大鼠。 操作熟練之后1 人完成此固定過程約需要1 min。

②秋千式懸掛

圖1 鼠衣成品圖Figure 1 Finished design of rat’s coat

圖2 大鼠鉆進鼠衣Figure 2 Rat getting into coat

取一段3 m 長的布帶條,每隔8 cm 左右剪1 個小孔,用來放置S 型掛鉤以懸掛大鼠。 將布帶條兩端固定于實驗室墻角兩側(cè)的墻壁,布帶條距離地面高度約為70 cm,以實驗人員坐在凳子上操作舒適省力為宜。 在大鼠前肢和后肢對應部位的鼠衣上分別開孔,用S 型掛鉤懸掛于布帶條上對應的孔內(nèi),使大鼠懸掛于布帶條上,處于“蕩秋千”微微擺動的狀態(tài)。 借助S 形掛鉤調(diào)節(jié)大鼠身體前后端與布帶條之間距離,使大鼠頭部在上,身體與地面呈45 度傾斜,見圖4。 最后用長尾夾收緊大鼠后肢根部的鼠衣,以充分暴露取穴部位。 操作熟練后1 人完成懸掛過程約需要30 S。

③溫針灸治療

大鼠針灸側(cè)腿部皮膚剃毛后,穴區(qū)用碘酒消毒后再以75%的乙醇脫碘,定位,毫針針刺腧穴,進針深度為5～7 mm。 將艾炷置于針柄,點燃艾炷下端,每次30 min,進針前在毫針上穿上隔熱紙板以防止溫針灸過程燙傷大鼠,見圖5。 治療過程多數(shù)大鼠處于閉目休息狀態(tài),針灸治療過程較為順利,見圖6。 治療結(jié)束后,取針和隔熱紙板,出血部位按壓止血、消毒。 剪開尼龍扎帶,解開大鼠的束縛,將其放回鼠籠。

圖3 固定大鼠Figure 3 Rat being fixed

圖4 秋千式懸掛Figure 4 Swinging rats

1.3.3 “鼠衣秋千式”固定法與束縛法的比較

從完成操作所需實驗人員數(shù)量、單只大鼠固定所需時間、大鼠在固定及溫針灸治療時的反應等方面比較“鼠衣秋千式”固定法與束縛固定法。

圖5 溫針灸治療Figure 5 Needle warming moxibustion treatment

圖6 溫針灸治療中的大鼠Figure 6 Rat in needle warming moxibustion treatment

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差()表示,以P＜0.05 時表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同固定方法固定單只大鼠所需實驗人員數(shù)量及時間的對比

完成大鼠固定和治療所需實驗人員數(shù)量以及固定單只大鼠所需時間如表1 所示。 可見,與束縛組相比,采用“鼠衣秋千式”法1 人即可完成固定和溫針灸治療;固定單只大鼠所需時間顯著減少(P＜0.01)。

2.2 溫針灸治療中不同固定方法組大鼠的反應對比

溫針灸治療過程,不同固定方法組大鼠的反應見表2。 “鼠衣秋千式”固定組有2 只大鼠在首次綁縛時候出現(xiàn)了較激烈的反應,占實驗組大鼠總數(shù)的比例為10.00%,在隨后的9 次固定操作中,其應激反應逐漸減弱。 束縛組有7 只大鼠在操作中出現(xiàn)了反應激烈、呼吸急促、燙傷等情況,所占比例為35.00%。 “鼠衣秋千式”固定組大鼠未出現(xiàn)攻擊咬傷操作人員情況,而束縛組大鼠在操作中有掙脫束縛、攻擊操作人員行為;“鼠衣秋千式”固定組大鼠在整個溫針灸2 個療程治療中,未見燙傷和死亡,有2 只大鼠出現(xiàn)掉針情況,而束縛組中則有12 只大鼠出現(xiàn)了掙扎掉針情況,占比高達60.00%,有6 只大鼠在捆綁或治療過程中死亡,占比達30.00%。

表1 不同方法固定單只大鼠所需人數(shù)、時間的對比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

表1 不同方法固定單只大鼠所需人數(shù)、時間的對比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

注:與束縛組(對照組)比較,*P＜0.01。Note. Compared with the bound rats Group (control group),*P＜0.01.

組別Groups完成操作所需人數(shù)(人)Number of people required單只大鼠固定時間(s)Time of fixing single rat鼠衣秋千式組Swinging rats bound with coat Group 1 89.20±3.93*束縛組Bound rats Group 2 110.85±15.64

表2 溫針灸治療中不同固定方法中大鼠的反應對比(n=20)Table 2 Comparison of rats’ reactions in different fixation methods in needle warming moxibustion

3 討論

“鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定裝置制作簡單、操作簡便,只需1 個實驗人員即可完成全部操作。與束縛固定法相比,該固定方法能減少所需操作人員數(shù)量,縮短固定單只大鼠的時間,有效地提高了實驗效率;大鼠在固定以及溫針灸治療中的掙扎情況得到顯著緩解,掉針大鼠數(shù)量減少,未發(fā)生燙傷、咬傷操作人員等情況;鼠衣秋千式大鼠在2 個療程的溫針灸治療中未出現(xiàn)死亡情況。 “鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定法,能使大鼠治療部位穴位暴露充分,操作安全簡便,且能提升工作效率,是一種較為適用于大鼠四肢部位溫針灸的固定方法。

理想的大鼠針灸固定方法應具有取穴方便、無應激刺激、操作安全簡便等特點,但就目前而言基本上難以完全做到。 為了盡可能降低固定對大鼠造成的應激反應對實驗結(jié)果的影響,課題組通過研究文獻、觀察大鼠習性,結(jié)合蕩秋千體驗,反復實踐改良后設計了“鼠衣秋千式”固定法。

與其他大鼠針灸固定方法相比,該法具有以下優(yōu)點:第一、充分利用了大鼠喜歡黑暗環(huán)境和喜歡鉆洞的生活習性,在其頭部被鼠衣覆蓋的情況下進行固定,有效地降低了大鼠被固定時的應激反應,且鼠衣能緩沖和分散固定時產(chǎn)生的束縛力,防止了大鼠的窒息死亡;第二、被“秋千式”懸掛于布帶條上的大鼠由于四肢和趾部無著力點無法發(fā)力,在整個30 min 的溫針灸治療過程中比較安靜,多數(shù)大鼠處于閉目睡覺狀態(tài),配合度較高,切實避免了劇烈掙扎導致的燙傷、攻擊操作人員等情況發(fā)生,保證了針灸時效的穩(wěn)定性;第三、大鼠四肢部位穴位暴露充分,便于治療。 此方法既適合于單純針刺治療,也適用于溫針灸治療;第四、鼠衣尺寸可調(diào)整,固定裝置適用范圍較廣,不僅適用于各種體型的大鼠,還可用于小鼠、豚鼠等動物;第五、實驗人員熟練操作后固定和懸掛一只大鼠約需要1.5 min,且不需助手即可單獨完成,提升了工作效率。 另外,該固定方法還具有取材方便、制作簡單、操作靈活等特點。

“鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定方法也存在一定的局限性,該法主要適用于動物四肢部位取穴治療,而對于頭部、背部以及腹部的針灸治療,則需要對鼠衣進行改良。 課題組將繼續(xù)改良和優(yōu)化該固定方法,以期操作更簡便,適用治療的部位更廣,并進一步降低固定時實驗動物的應激反應對針灸療效的干擾作用。