郭鑫，李剛，葉辰，阿卜杜·海拜爾·薩杜拉，任思謙，袁蒙，孟猛，錢海利，原春輝

（1.北京大學(xué)第三醫(yī)院 普通外科，北京 100191；2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京 100027）

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumors，pNETs）是一類起源于胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的罕見腫瘤。隨著診斷水平的提高和對該疾病認(rèn)識的加深，pNETs發(fā)病率和檢出率正逐年上升。根據(jù)臨床表現(xiàn)，pNETs可分為功能性和無功能性，pNETs確切的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。由于pNETs早期無明顯癥狀，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。尋找新的有效治療方法，對于pNETs的治療和預(yù)后至關(guān)重要。

TOPK（T-LAK cell-originated protein kinase），也被稱作PBK（PDZ-binding-kinase），是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[2-3]，TOPK屬于MAPK激酶家族成員，與細(xì)胞有絲分裂紡錘體的形成相關(guān)，TOPK在染色體的正確分離和細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用[4]。TOPK主要表達(dá)于高增殖水平的組織，在成年人正常組織中，睪丸組織的表達(dá)最高[2]。TOPK在結(jié)腸癌[5]、食管癌[6]、淋巴瘤[7]、肺癌[8]等多種腫瘤中高表達(dá)。研究表明，TOPK可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，并與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[10]。在胰腺癌中，TOPK高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)，TOPK通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 和基因啟動子活性直接調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力[11]。因此，使用TOPK靶向抑制劑可能成為治療胰腺腫瘤的一個新方法。HITOPK-032是由Kim等[5]利用體外激酶檢測篩選并鑒定出的新型TOPK抑制劑，HI-TOPK-032能強(qiáng)烈抑制TOPK活性，抑制結(jié)腸癌異種移植腫瘤模型的生長?；赥OPK在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究旨在探討使用TOPK抑制劑HI-TOPK-032 對胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1細(xì)胞體外表型的影響，期望能以TOPK為突破口為pNETs的治療尋找新藥物。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1、QGP-1細(xì)胞購自于北京北納生物技術(shù)有限公司。HPDE、Mia-2、SW-1990 細(xì)胞系均為本實驗室自存細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基為10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱；6孔板、96孔板、培養(yǎng)皿購自于Corning公司；HI-TOPK-032購自于MCE公司，用DMSO溶解后儲存在-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?；TOPK抗體購自于proteintech公司，Tubulin抗體購自于CST公司，PI母液購自于北京普益華科技有限公司，Annexin V試劑購自于賽默飛公司。

1.2 TOPK蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blotting法。待檢測細(xì)胞PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，每10 min振蕩一次，將細(xì)胞裂解液4 ℃、12 000 r/min離心15 min。測濃度，加入5×緩沖液煮樣10 min。計算蛋白上樣量后在10% PAGE膠上電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放置于4 ℃含有50 g/L脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育。TBST清洗3遍，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，清洗后化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光。

1.3 細(xì)胞增殖檢測

采用CCK-8 法。取生長狀態(tài)良好的待檢測細(xì)胞，PBS清洗，胰酶消化，使用完全培養(yǎng)基終止并計數(shù)；調(diào)整細(xì)胞懸液至合適濃度，在96 孔板中每個孔種2×103個細(xì)胞，培養(yǎng)基體積定容至100 μL，每種細(xì)胞重復(fù)3次，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，溫箱內(nèi)孵育2 h；酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.4 細(xì)胞克隆形成檢測

平板克隆形成實驗法。取生長狀態(tài)良好的待檢測細(xì)胞，PBS清洗，胰酶消化，使用完全培養(yǎng)基終止消化后計數(shù)；調(diào)整細(xì)胞懸至合適濃度，每個中皿種2×103個細(xì)胞，每種細(xì)胞重復(fù)3次，充分搖晃均勻后置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)兩周左右；每隔4 d更換一次培養(yǎng)基，待每個細(xì)胞單克隆長到大于50個細(xì)胞時，終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇固定，0.5%的結(jié)晶紫染色，流水沖洗干凈，室溫晾干后拍照計數(shù)。

1.5 細(xì)胞遷移和侵襲檢測

Transwell法。遷移實驗時，取生長狀態(tài)良好的待檢測細(xì)胞，胰酶消化，PBS清洗，使用完全培養(yǎng)基終止消化后計數(shù)；用不同濃度HI-TOPK-032的無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液至合適濃度，取1.5×105個BON-1細(xì)胞接種于上室，體積200 μL，下室加入600 μL含20%血清的RMPI-1640 完全培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度藥物，待適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞穿過小室后，終止實驗，甲醇固定，0.5%結(jié)晶紫染色，自來水沖洗，擦去未穿過小室的細(xì)胞，室溫晾干后拍照、計數(shù)，每組實驗設(shè)置3 個重復(fù)。侵襲實驗，將融化后的Matrigel膠稀釋到終濃度為50 mg/L（1:40稀釋液）；吸取100 μL 1:40稀釋后的Matrigel膠溶液加入到Transwell小室，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，其他方法同遷移實驗。

1.6 細(xì)胞周期檢測

將適量的BON-1 細(xì)胞種于6 孔板中，培養(yǎng)基分別為含0、1、2.5、5 μmol/L HI-TOPK-032的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，胰酶消化，PBS清洗離心，75%乙醇，-20 ℃過夜固定；預(yù)先配制PI工作液，1 000 r/min，5 min離心細(xì)胞懸液，棄去上清，加入400 μL PI工作液，冰上避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 BON-1細(xì)胞凋亡和壞死檢測

將BON-1細(xì)胞種于6孔板中，培養(yǎng)基分別為含0、1、2.5、5 μmol/L HI-TOPK-032的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；離心收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞碎片，PBS清洗并離心收集細(xì)胞碎片，胰酶消化，PBS清洗，離心；細(xì)胞中加入100 μL的1×Binding buffer，加入5 μL的Annexin V和PI工作液室溫條件下避光染色15 min；加入400 μL的1×Binding buffer，1 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Image J軟件計算Western blotting蛋白條帶的灰度值并計算蛋白相對表達(dá)量。使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用ANOVA方差分析比較對照組與實驗組間結(jié)果差異，組間比較采用LSD-t多重檢驗，所有數(shù)據(jù)采用（）表示。使用Graphpad Prism軟件7.0版制作圖片。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOPK在多種胰腺腫瘤中高表達(dá)

我們通過Western blotting實驗檢測正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE）與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系Mia-2、SW-1990和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞系BON-1、QGP-1 中TOPK的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與HPDE相比，TOPK蛋白表達(dá)水平在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系Mia-2、人胰腺癌細(xì)胞系SW-1990細(xì)胞系和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞系BON-1中表達(dá)顯著上調(diào)（TOPK蛋白相對表達(dá)量比值分別為1.0:2.6:1.7:2.3:1.0），如圖1所示。

圖1 TOPK蛋白在正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPED）、胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞（Mia-2、SW-1990）和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞（BON-1、QGP-1）中的表達(dá)情況

2.2 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細(xì)胞增殖

我們通過CCK-8 實驗檢測在含0、1、2.5、5 μmol/L濃度的HI-TOPK-032培養(yǎng)基中BON-1細(xì)胞在24、48和72 h生長情況觀察細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，在72 h時，實驗組BON-1細(xì)胞體外增殖被顯著抑制，增殖隨濃度增加依次降低（22.2±8.2）%、（90.4±1.0）%、（89.7±0.9）%（P＜0.001），如圖2A所示。

2.3 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細(xì)胞克隆形成

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032培養(yǎng)基培養(yǎng)BON-1細(xì)胞系，計算克隆形成數(shù)目，檢測其對BON-1細(xì)胞克隆形成的作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，HI-TOPK-032處理BON-1細(xì)胞后，克隆形成能力被顯著抑制，克隆隨濃度增加依次減少（19.1±2.1）%、（42.5±5.7）%、（87.0±5.6）%（P＜0.001），如圖2B、2C所示。

圖2 HI-TOPK-032抑制BON-1細(xì)胞增殖和克隆形成

2.4 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力

我們通過Transwell實驗檢測0、1、2.5、5 μmol/L濃度的HI-TOPK-032培養(yǎng)基對BON-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力抑制效果。結(jié)果表明，HI-TOPK-032可有效地抑制BON-1細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力，與對照組相比，BON-1細(xì)胞遷移能力隨濃度增加依次減弱（9.3±5.6）%、（70.5±4.0）%、（87.5± 3.5）%（P＜0.01），侵襲能力隨濃度增加依次減弱（23.0±4.2）%、（60.7±5.4）%、（93.6±3.0）%（P＜0.01），如圖3所示。

圖3 HI-TOPK-032顯著抑制BON-1細(xì)胞遷移和侵襲形成

2.5 HI-TOPK-032影響B(tài)ON-1細(xì)胞的細(xì)胞周期

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032培養(yǎng)基培養(yǎng)BON-1細(xì)胞系72 h，使用流式檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，與對照組相比，使用2.5、5 μmol/L濃度HI-TOPK-032后，G0/G1期的細(xì)胞比例依次增加（12.2±2.0）%、（18.3±1.4）%（P＜0.001），在5 μmol/L濃度時，S期的細(xì)胞比例減少（18.4±6.1）%（P＜0.01），在2.5、5 μmol/L濃度時，G2/M期的細(xì)胞比例依次減少（17.6±8.6）%、（16.4±4.5）%（P＜0.001），這提示2.5 μmol/L濃度以上時，HI-TOPK-032可以調(diào)控BON-1細(xì)胞周期進(jìn)程，如圖4所示。

圖4 HI-TOPK-032調(diào)控BON-1細(xì)胞周期

2.6 HI-TOPK-032顯著促進(jìn)BON-1細(xì)胞壞死和凋亡

分別使用0、1、2.5、5 μmol/L 濃度的HITOPK-032 培養(yǎng)基培養(yǎng)BON-1 細(xì)胞系72 h，使用Annexin V染色，流式檢測凋亡。結(jié)果顯示，HITOPK-032 顯著促進(jìn)BON-1 細(xì)胞壞死和凋亡，凋亡隨濃度增加依次增加（60.6±30.9）%（P＜0.05）、（79.5±27.5）%（P＜0.01）、（165.8±34.9）%（P＜0.001），5 μmol/L濃度時，壞死顯著增加，增加（385.8±67.3）%（P＜0.001），如圖5所示。

圖5 HI-TOPK-032促進(jìn)BON-1細(xì)胞凋亡和壞死

3 討論

TOPK通過持續(xù)維持致癌底物的磷酸化，使癌細(xì)胞克服細(xì)胞死亡信號通路，繞過調(diào)控檢查點控制，從而促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展，抑制TOPK是克服腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移性生長和治療耐藥性的一種重要的治療策略[9，12]。

HI-TOPK-032作為一種TOPK特異性抑制劑，在多種腫瘤中顯示出良好的抑制腫瘤的效果[13-19]。HITOPK-032 通過抑制ERK磷酸化從而抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖[5]，通過抑制c-Jun磷酸化從而抑制皮膚癌細(xì)胞增殖和克隆形成[12]，可以抑制鼻咽癌、膠質(zhì)瘤異種移植瘤的生長[14-15]。HI-TOPK-032 可以阻滯淋巴瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]。

在本研究中，使用不同濃度的HI-TOPK-032均可以抑制胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1細(xì)胞的體外增殖和克隆形成，且抑制效果呈劑量依賴式。TOPK在有絲分裂過程中起到重要作用，TOPK能強(qiáng)烈促進(jìn)了細(xì)胞分裂[4，17]。本研究中，使用HI-TOPK-032可以特異性抑制BON-1 細(xì)胞中TOPK活性，從而抑制BON-1細(xì)胞分裂，使BON-1細(xì)胞的增殖和克隆形成能力減弱。本研究結(jié)果表明，使用HI-TOPK-032可以顯著抑制BON-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這提示HI-TOPK-032具有防止腫瘤轉(zhuǎn)移的潛力。腫瘤細(xì)胞最顯著的特征之一是細(xì)胞周期異常，探索調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期的方法成為腫瘤治療的重要方法[18]。本研究核心之處是通過流式檢測了使用不同濃度HITOPK-032 對BON-1 細(xì)胞周期和凋亡壞死的影響，結(jié)果表明，在HI-TOPK-032濃度大于2.5 μmol/L后，G0/G1期的細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，證明了較高濃度的HI-TOPK-032能夠提供調(diào)控BON-1細(xì)胞周期，將BON-1細(xì)胞的分裂阻滯在G0/G1期。同時，使用HI-TOPK-032 抑制TOPK活性導(dǎo)致BON-1細(xì)胞凋亡和壞死顯著增加，在5 μmol/L濃度時，促進(jìn)BON-1細(xì)胞凋亡和壞死的效果均最顯著。

HI-TOPK-032在多種腫瘤中以劑量依賴的方式抑制腫瘤的增殖和活力[5，19]。在本研究表明，HITOPK-032 濃度在1～5 μmol/L時，在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1 細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲等體外惡性表型被顯著抑制。較高濃度的HITOPK-032可以調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)凋亡和壞死。

本研究首次表明，HI-TOPK-032能調(diào)控胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1 細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤凋亡壞死，顯著抑制BON-1細(xì)胞體外惡性表型，證明了HITOPK-032 作為TOPK靶向抑制劑在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的應(yīng)用價值，同時也為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤動物體內(nèi)移植瘤模型的藥理實驗研究提供重要依據(jù)。

本研究不足之處，一是未闡明HI-TOPK-032在BON-1細(xì)胞中發(fā)揮抑制惡性表型作用的分子生物學(xué)機(jī)制；二是未開展動物體內(nèi)實驗驗證其抑制效果和量效關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究表明，在體外試驗中，HI-TOPK-032 顯著抑制胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤BON-1 細(xì)胞系的惡性表型的效果，有效抑制了BON-1 細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移，調(diào)控BON-1 細(xì)胞周期，促進(jìn)BON-1細(xì)胞的凋亡和壞死。目前針對HI-TOPK-032的藥物策略的開發(fā)仍處于臨床前階段。預(yù)期在未來，在pNETs患者中，經(jīng)免疫組化檢查，對TOPK陽性表達(dá)的患者使用TOPK抑制劑可能有效抑制腫瘤的生長，提高患者生存率，改善不良預(yù)后。