陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)基因GhEXPs的分析及表達(dá)研究

呂麗敏，左東云，王省芬，張友平，程海亮，王巧連，宋國(guó)立,4*，馬峙英*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北基地，河北 保定071001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng)455000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071001；4.鄭州大學(xué)/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州基地，鄭州450001）

擴(kuò)展蛋白（Expansin）是一類重要的細(xì)胞壁蛋白，在酸性條件下它能松弛細(xì)胞壁，促使細(xì)胞增大[1-2]。擴(kuò)展蛋白在細(xì)菌、真菌和高等植物中以多基因家族的形式廣泛存在，在促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、莖尖和根伸長(zhǎng)、葉片的形態(tài)建成、花和果實(shí)的發(fā)育、胚胎發(fā)生、花粉發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮著重要作用[3-6]。McQueen-Mason團(tuán)隊(duì)最早從黃瓜幼苗中分離出有活性的擴(kuò)展蛋白，研究表明該蛋白在酸性、離體條件下能夠促進(jìn)下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)[7]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速進(jìn)步和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家從植物和微生物中鑒定了多個(gè)物種的擴(kuò)展蛋白基因家族。通過對(duì)擬南芥[9]、大豆[10]、水稻[9]、大白菜[11]、楊樹[12]、煙草[13]等植物擴(kuò)展蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，植物類擴(kuò)展蛋白家族包括4個(gè)亞家族，分別為α-擴(kuò)展蛋白（EXPA）、β-擴(kuò)展蛋白（EXPB）、類α-擴(kuò)展蛋白（expansin-like A,EXLA）和類β-擴(kuò)展蛋白（expansin-like B,EXLB）[8]。該家族蛋白通常包含250～275個(gè)氨基酸殘基，氮端有包含20～30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，屬于分泌蛋白[3]。擴(kuò)展蛋白包括2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，分別是位于氮端的DPBB（Double-psi betabarrel）和碳端的CBM 63（Fam ily-63 carbohydrate binding module），其中DPBB是1個(gè)六鏈雙“ψ”β-桶形結(jié)構(gòu)，CBM 63是碳水化合物結(jié)合模塊家族-63結(jié)構(gòu)域[4]。結(jié)構(gòu)分析表明，2個(gè)擴(kuò)展蛋白分子中間夾1個(gè)細(xì)胞壁多糖形成“三明治”式的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是擴(kuò)展蛋白促使細(xì)胞壁發(fā)生松弛的作用模型[3]。

棉花纖維是胚珠表皮細(xì)胞分化伸長(zhǎng)的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它的特殊伸長(zhǎng)機(jī)制一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，棉花纖維是研究單細(xì)胞伸長(zhǎng)的模式系統(tǒng)[14]。棉花纖維發(fā)育過程分為5個(gè)時(shí)期，分別是起始期、伸長(zhǎng)期、轉(zhuǎn)換期、次生壁合成期和成熟期，各個(gè)時(shí)期之間存在交互重疊，沒有嚴(yán)格的界限[15]。擴(kuò)展蛋白參與棉花纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)過程已取得了一些進(jìn)展[16-18]，科學(xué)家利用棉花纖維的cDNA（Complementary DNA，互補(bǔ)DNA）文庫(kù)、基因芯片、SSH（Suppression subtractive hybridization，抑制差減雜交）文庫(kù)等技術(shù)從棉花中篩選出在纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因[19-20],發(fā)現(xiàn)EXPA亞家族的2個(gè)基因GhExp1和GhExp2在棉花纖維中高表達(dá)[21]，后來證明這2個(gè)基因是位于棉花A亞組和D亞組的1對(duì)同源基因[22]。在陸地棉中過表達(dá)GhEXPA8基因能顯著促進(jìn)纖維的伸長(zhǎng)[23]；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)GhEXPA8和上述的GhExp2是同一個(gè)基因。通過對(duì)陸地棉擴(kuò)展蛋白全基因組分析，采用系統(tǒng)命名法將該基因命名為GhEXPA2，染色體定位分析發(fā)現(xiàn)它位于D亞組[22]。此外，從海島棉A亞組獲得了1個(gè)擴(kuò)展蛋白基因GbEXPATR，屬于EXPA亞家族，過表達(dá)該基因能夠使棉纖維變得更長(zhǎng)、更細(xì)，強(qiáng)度更強(qiáng)。與陸地棉GhEXPA2相比，GbEXPATR缺少CBM 63結(jié)構(gòu)域，這可能與它在海島棉中的特殊功能有關(guān)[16]。近來，對(duì)陸地棉擴(kuò)展蛋白基因家族的研究鑒定了93個(gè)GhEXPs基因，發(fā)現(xiàn)一些基因在纖維發(fā)育中上調(diào)表達(dá)[22]。這些研究表明，擴(kuò)展蛋白在纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

早期科學(xué)家認(rèn)為擴(kuò)展蛋白通過減弱多糖和纖維素微纖絲之間的連接作用，從而使細(xì)胞壁松弛[2]，也可能是通過清除纖維素和多糖之間的氫鍵使細(xì)胞壁松弛[8]。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁中的纖維素微纖絲呈束狀分層排列，并把纖維素微纖絲交叉的位置稱為“生物力學(xué)熱點(diǎn)（biomechanical hotspots）”，該區(qū)域存在的細(xì)胞壁多糖使纖維素微纖絲連接在一起[24]。目前，科學(xué)家已經(jīng)獲得了細(xì)菌擴(kuò)展蛋白 EXLX1（Expansin-Like X）和玉米EXPB亞家族的擴(kuò)展蛋白EXPB1（Zea m1）的晶體結(jié)構(gòu)。研究表明，芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是擴(kuò)展蛋白和多糖底物相互結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，并且十分保守[25-26]。擴(kuò)展蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析為我們深入了解其生物學(xué)功能和機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步闡釋棉花纖維伸長(zhǎng)的作用機(jī)制，解析擴(kuò)展蛋白在棉花纖維發(fā)育過程中發(fā)揮的作用。本文從陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了4個(gè)在纖維發(fā)育過程中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因GhEX PA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a，對(duì)這4個(gè)GhEXPs基因的進(jìn)化關(guān)系、蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式等方面進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料陸地棉（Gossypium hirsutumL.）標(biāo)準(zhǔn)系TM-1是來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源中期庫(kù)的資源，本課題組種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院老所部試驗(yàn)基地（河南省安陽(yáng)縣，36°06′84.44″N,114°49′61.5″E）保存使用，田間常規(guī)管理。在盛花期對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行掛牌，分別于開花當(dāng)天（0 day post anthesis,0 DPA）、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA的胚珠和纖維進(jìn)行取樣，5 DPA及之前時(shí)間點(diǎn)的樣品是胚珠和纖維未分離的材料，其余時(shí)間點(diǎn)的樣品均是從胚珠上剝離的纖維材料。冰上取材后立即放入液氮速凍，于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和c DNA制備

RNA提取按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP441，北京天根生化科技有限公司）說明書及參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行操作[22]。

提取的RNA放置－80℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用超純水稀釋10倍后，－20℃冰箱保存，用于后面實(shí)驗(yàn)。步驟參考Takara公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號(hào)：6210A）的說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[22]。

1.2.2 棉花GhEXPs基因的克隆

從棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cottonfgd.org/）[27]獲得4個(gè)GhEXPs的開放閱讀框，分別為Ghir_D05G018790.1（GhEXPA1d）、Ghir_A04G009030.1（GhEXPA4b）、Ghir_A05G038370.1（GhEXPA23b）和Ghir_A12G014930.1（Gh-EXPB3a）。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增每個(gè)基因的開放閱讀框（Open read frame,ORF），然后把序列連到pMDTM18-T載體上進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證?；蚩寺∷玫囊镄蛄幸姳?。

表1 基因開放閱讀框擴(kuò)增的PCR引物Table 1 The primers for GhEXPs gene open read frame am plification

1.2.3 棉花GhEXPs基因的進(jìn)化分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)建模

利用MEGA 6.0軟件對(duì)4個(gè)GhEXPs蛋白以及其它物種的擴(kuò)展蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[28]。構(gòu)建進(jìn)化樹所用擬南芥蛋白序列來自擬南芥TAIR網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/），陸地棉擴(kuò)展蛋白序列來自相關(guān)報(bào)道[22]，其他物種的擴(kuò)展蛋白序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，用4個(gè)GhEXPs蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST。選擇了包括單子葉、雙子葉植物以及擴(kuò)展蛋白不同亞家族成員，包括草莓：FaExp2（AF159563），歐洲甜櫻桃：PraExp1（AF297521）、PraExp2（AF297522），黃瓜：CsExp1（U30382）、CsExp2（U30460），番茄：LeExp1（U82123）、LeExp2（AF096776）、LeExp3（AF059487）、LeExp4（AF059488）、LeExp5（AF0-59489）、LeExp8（AF184232），水稻：OsExp1（Y07782）、OsExp4（U85246），獨(dú) 腳 金：SaExp3（AF291659），百日草：ZeExp3（AF230333），歐洲油菜：BnExp1（AJ000885），煙草：NtExp1（AF04-9350.1），豌豆：PsExp1（X85187），小麥：TaEXPA2（AAS48871.1），玉米：EXPB1_Zea m1（AAO45-608.1）。

將4個(gè)GhEXPs蛋白序列去掉信號(hào)肽后，利用 在 線 軟 件 Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)[29]，然后利用軟件PyMOL V2.3.4對(duì)蛋白模型進(jìn)行可視化處理，再用Adobe Illustrator CS3 13.0.0編輯圖片標(biāo)注關(guān)鍵氨基酸信息。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

從0 DPA、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA纖維和胚珠樣品中提取的總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。此外，從Cotton FGD（Cotton Functional Genom icsDatabase，https://cottonfgd.org/）[27]數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了其它組織樣品的RNA-Seq數(shù)據(jù)，樣品包括：根、莖、葉、苞葉、花瓣、雄蕊、雌蕊和花托。測(cè)序結(jié)果的基因表達(dá)量用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)（Fragments per kilobase of m illion mapped reads,FPKM）表示。

1.2.5 目的基因的表達(dá)分析

通過qRT-PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，實(shí)時(shí)定量PCR）檢測(cè)0 DPA、3 DPA、5 DPA、7 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和30 DPA不同時(shí)期的棉花胚珠和纖維樣品中4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)情況。以UBQ7（GenBank登錄號(hào)：AY189972）為內(nèi)參基因，引物見表2。試驗(yàn)所用試劑盒為Takara公司生產(chǎn)的TB GreenTMPrem ix Ex TaqTMII Kit（貨號(hào)：RR820A），采用美國(guó)ABI的QuantStudioTM5熒光定量PCR儀。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[30]。利用Excel 2010進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因的克隆及進(jìn)化分析

本研究中4個(gè)GhEXPs基因（GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a）開放閱讀框分別為768 bp、795 bp、798 bp和804 bp。將GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和Gh-EXPB3a與棉屬及其他物種的擴(kuò)展蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），發(fā)現(xiàn)GhEXPA4b、EXPA1d和GhEXPA23b分別屬于EXPA亞家族的第Ⅳ、Ⅴ和Ⅻ亞組，即EXPA-Ⅳ、EXPA-Ⅴ和EXPA-Ⅻ；GhEXPB3a屬于EXPB亞家族的第Ⅱ亞組，即EXPB-Ⅱ（圖1）。

表2 定量PCR的引物Table 2 The primers for qRT-PCR

2.2 陸地棉4個(gè)GhEXPs蛋白的三維建模及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

目前植物中僅有玉米EXPB1和細(xì)菌中的EXLX1兩個(gè)擴(kuò)展蛋白解析了晶體結(jié)構(gòu)，位于EXPB1和EXLX1三維結(jié)構(gòu)表面的芳香族氨基酸是它們和細(xì)胞壁多糖結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。為尋找棉花纖維細(xì)胞壁中擴(kuò)展蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，本研究把陸地棉的4個(gè)GhEXPs蛋白與上述2個(gè)蛋白進(jìn)行序列比對(duì)（圖2），鑒定關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DPBB結(jié)構(gòu)域中，棉花4個(gè)擴(kuò)展蛋白GhEXPs與玉米EXPB1的色氨酸W 26和酪氨酸Y27對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)也是2個(gè)保守的芳香族氨基酸，其中GhEXPB3a與玉米EXPB1對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸完全相同，其余3個(gè)GhEXPs與W 26位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基為苯丙氨酸（F），4個(gè)Gh-EXPs與Y27對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)沒有發(fā)生變異。在CMB63結(jié)構(gòu)域中，玉米擴(kuò)展蛋白EXPB1的關(guān)鍵位點(diǎn)是Y 160和W 194，4個(gè)GhEXPs蛋白與Y160對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)變異為W或F（GhEXPA23b除外），與W 194對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)完全相同，沒有發(fā)生變異（圖2）。同時(shí)，4個(gè)GhEXPs與微生物擴(kuò)展蛋白EXLX1也進(jìn)行了比對(duì)，EXLX1中兩個(gè)連續(xù)的色氨酸W 125、W 126是該蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，4個(gè)GhEXPs與W 125、W 126對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)變異為YF（GhEXPA23b與W 126對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)除外）2個(gè)芳香族氨基酸（圖2）。

圖1 4個(gè)GhEXPs蛋白與其它植物擴(kuò)展蛋白的聚類分析Fig.1 Phylogenetic tree of the four GhEXPs and other plant expansins

利用在線軟件建立了陸地棉4個(gè)擴(kuò)展蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，參考模型是玉米EXPB1（模板編號(hào)：c2hczX）的結(jié)構(gòu)，建模結(jié)果如圖3所示。GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和Gh-EXPB3a與玉米EXPB1的序列一致性分別為31%、34%、32%和42%，模型可信度均為100%。從三維結(jié)構(gòu)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果來看，GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a蛋白均包含DPBB和CBM 63兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中DPBB是典型的六鏈雙“ψ”β-桶結(jié)構(gòu)，2個(gè)結(jié)構(gòu)域上分布有芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。我們把序列比對(duì)得到的關(guān)鍵芳香族氨基酸標(biāo)注在三維結(jié)構(gòu)圖中（圖3），在DPBB結(jié)構(gòu)域中，Gh-EXPA1d的F13、Y14，GhEXPA4b的F18、Y19，GhEXPA23b的F22、Y23和GhEXPB3a的W 19、Y20位于結(jié)構(gòu)的表面；而GhEXPA1d的W 183、F150，GhEXPA4b的W 187、F154，GhEXPA23b的W 190，Y155和GhEXPB3a的W 188、Y154位于CBM 63結(jié)構(gòu)域的表面（圖3）。

圖2 4個(gè)GhEXPs與EXLX1和EXPB1的序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of 4 GhEXPs and EXLX1 and EXPB1

從三維結(jié)構(gòu)圖可以看出，每個(gè)擴(kuò)展蛋白均有4個(gè)芳香族氨基酸分布在同一平面上，GhEXPA1d包括F13、Y14、F150和W 183，GhEXPA4b包括F18、Y19、F154和W 187，GhEXPA23b包括F22、Y23、W 190和Y155，GhEXPB3a包括W 19、Y20、W 154和W 188（圖3），但GhEXPA1d、Gh-EXPA4b和GhEXPB3a中與EXLX1的W 125對(duì)應(yīng)的芳香族氨基酸和它們并不在一個(gè)平面上（圖3）。而這些位于同一平面的保守氨基酸在細(xì)胞壁中與多糖結(jié)合可能是松弛細(xì)胞壁的關(guān)鍵。

2.3 陸地棉中4個(gè)GhEXPs基因的組織表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析4個(gè)GhEXPs基因在棉花纖維發(fā)育不同時(shí)期及其他組織的表達(dá)情況（圖4）?？傮w來看，GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a在胚珠和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在其他組織包括根、莖、葉、苞葉、花瓣、雄蕊、雌蕊和花托表達(dá)水平很低。其中GhEXPA1d和GhEXPA23b這兩個(gè)基因在纖維中特異表達(dá)，在其他組織中基本不表達(dá)；GhEXPA4b和Gh-EXPB3a在纖維之外的其它組織如葉片、雄蕊、雌蕊等有較低水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果初步分析表明，4個(gè)GhEXPs是在纖維發(fā)育中明顯優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因。

圖3 陸地棉4個(gè)GhEXPs蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The predicted three-dimensional structures of 4 GhEXPs

2.4 qRT-PCR分析驗(yàn)證4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)情況

為進(jìn)一步驗(yàn)證4個(gè)陸地棉擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)情況，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)4個(gè)GhEXPs基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。從圖5可以看出，4個(gè)GhEXPs基因在纖維發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄測(cè)序的結(jié)果基本一致（圖4和圖5）。GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a均在纖維發(fā)育的起始期和伸長(zhǎng)期上調(diào)表達(dá)。其中GhEXPA1d和GhEXPB3a在開花當(dāng)天（0 DPA）表達(dá)量相對(duì)較高，他們分別在開花后10 d和20 d的表達(dá)水平急劇下降（圖5）；GhEXPA4b和Gh-EXPA23b在花后3～7 d表達(dá)量高，然后表達(dá)量開始下降（圖5）。此外，EXPA亞家族的3個(gè)基因在纖維中的表達(dá)情況也不相同，GhEXPA1d和GhEXPA4b的表達(dá)水平明顯高于GhEXPA23b。

3 討論

圖4 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因在不同纖維樣品和組織中的轉(zhuǎn)錄組分析Fig.4 The transcriptome analysis of 4 GhEXPs from fiber and other tissues

本研究鑒定了4個(gè)在棉花纖維中特異表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因，其中3個(gè)屬于EXPA亞家族，1個(gè)屬于EXPB亞家族，這與陸地棉擴(kuò)展蛋白基因EXPA亞家族占優(yōu)勢(shì)的結(jié)果一致[22]。蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確行使功能的基礎(chǔ)。在蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的DPBB結(jié)構(gòu)域上，對(duì)比棉花4個(gè)GhEXPs與玉米EXPB1、細(xì)菌EXLX1的關(guān)鍵保守位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，在這些關(guān)鍵位點(diǎn)也都是芳香族氨基酸，暗示了它們可能與玉米EXPB1和細(xì)菌EXLX1具有相似的功能，但個(gè)別氨基酸的差異，又凸顯了物種之間的不同。

最近利用固態(tài)核磁共振（Solid-state nuclear magnetic resonance，ss-NMR）技術(shù)揭示了EXPB1蛋白結(jié)合的底物是半纖維素葡萄糖醛阿拉伯聚糖（GAX，glucuronoarabinoxylan）[31]，點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)表明了EXLX1的結(jié)合底物主要是纖維六糖[3,32]。在本研究中，根據(jù)同源序列比對(duì)和建模分析，我們發(fā)現(xiàn)陸地棉4個(gè)GhEXPs與已報(bào)道的解析出晶體結(jié)構(gòu)的玉米擴(kuò)展蛋白EXPB1的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)基本相同，并與細(xì)菌中已經(jīng)解析結(jié)構(gòu)的EXLX1蛋白中在關(guān)鍵的芳香族氨基酸位點(diǎn)也有較高的一致性。由此推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的棉花擴(kuò)展蛋白可能具有類似的功能。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁纖維素在聚合粘連位置形成“生物力學(xué)熱點(diǎn)”，在這些位點(diǎn)起黏合作用的就是半纖維素成分，擴(kuò)展蛋白就是通過結(jié)合這些半纖維分子把它們從纖維素上解鎖從而松弛細(xì)胞壁的[24]。棉花纖維細(xì)胞壁的半纖維素成分有木葡聚糖、甘露聚糖和葡萄糖醛阿拉伯聚糖（GAX）等[15]。我們推測(cè)棉花擴(kuò)展蛋白也可能是通過與棉花纖維細(xì)胞中的半纖維成分結(jié)合而使細(xì)胞壁發(fā)生松弛，從而在內(nèi)部膨壓的驅(qū)動(dòng)下使纖維細(xì)胞不斷擴(kuò)展。然而，棉花擴(kuò)展蛋白在纖維細(xì)胞壁內(nèi)的生物機(jī)制以及具體結(jié)合的半纖維種類仍需要進(jìn)一步深入研究。

圖5 陸地棉4個(gè)GhEXPs基因的qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR analysis of 4 GhEXPs in upland cotton

擴(kuò)展蛋白廣泛分布在植物和微生物的細(xì)胞壁中，通過松弛細(xì)胞壁促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)展[3,24,33]。研究表明，外加細(xì)胞壁蛋白的提取物能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。擬南芥根毛特異基因AtEXPA7的RNAi（RNA interference，RNA干擾）試驗(yàn)可明顯降低根毛細(xì)胞的長(zhǎng)度，與野生型對(duì)照相比，RNAi株系根毛長(zhǎng)度減少了25%～48%[6]。擴(kuò)展蛋白在參與棉花纖維發(fā)育也有諸多報(bào)道[16-18]，GhEXPA1（即GhExp1[21]）在開花后6～28 d的纖維中特異表達(dá)且是表達(dá)水平高的基因，Xu等[18]研究表明，GhEXPA1和GhRDL1相互作用共同調(diào)控纖維的伸長(zhǎng)。Li等[16]獲得海島棉擴(kuò)展蛋白基因GbEXPATR，過表達(dá)該基因能明顯促進(jìn)棉花纖維的伸長(zhǎng)。擴(kuò)展蛋白基因具有明顯的時(shí)空和組織表達(dá)特異性。在棉花纖維發(fā)育中已經(jīng)鑒定了位于A亞組和D亞組上的一對(duì)同源擴(kuò)展蛋白基因GhExp1和GhExp2[21]，RNA印記實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明二者在纖維發(fā)育不同時(shí)期高表達(dá)，而在根、莖、葉等組織中不表達(dá)，超表達(dá)GhEXPA8（即GhExp2）基因可以明顯促進(jìn)棉纖維的伸長(zhǎng)[23,25]。本研究篩選獲得的陸地棉擴(kuò)展蛋白基因GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a也是在棉花纖維中特異表達(dá)，在根、莖、葉等組織中表達(dá)量低（圖4），推測(cè)這些擴(kuò)展蛋白基因在促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)發(fā)育過程中也可能發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

本文從陸地棉中獲得了4個(gè)在纖維中特異表達(dá)的擴(kuò)展蛋白基因，分別是GhEXPA1d、Gh-EXPA4b、GhEXPA23b和GhEXPB3a，前3個(gè)基因?qū)儆贓XPA亞家族，GhEXPB3a屬于EXPB亞家族。其編碼的蛋白均含有DBPP和CBM 63兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。三維結(jié)構(gòu)建模分析發(fā)現(xiàn)，芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分布在擴(kuò)展蛋白2個(gè)結(jié)構(gòu)域表面的4個(gè)位點(diǎn)，這些氨基酸處于同一平面上，可能是底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。4個(gè)基因在根、莖、葉、苞葉等組織中表達(dá)量低，在棉花纖維組織發(fā)育的前期優(yōu)勢(shì)表達(dá)。本研究為闡明擴(kuò)展蛋白基因?qū)w維發(fā)育的調(diào)控提供了理論依據(jù)。