于聰，李艷，2*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

花色苷（anthocyanin）是葡萄果皮中的主要呈色物質(zhì)，屬于類黃酮化合物，表現(xiàn)為蔬菜和水果的紅色、紫色和藍(lán)色等鮮艷的色彩[1]。釀酒葡萄中的花色苷是以C6-C3-C6為基本骨架，以糖苷鍵與糖結(jié)合而成的一類黃酮多酚類化合物[2-3]，2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子的多羥基或多甲氧基衍生物，含有2個(gè)被含氧雜環(huán)（C）分開(kāi)的苯甲酰環(huán)（A、B），花色苷母核結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1?；ㄉ战Y(jié)構(gòu)上的R1、R2基團(tuán)有6種組合，可形成具體的花色苷[4-5]，見(jiàn)表 1。

表1 最常見(jiàn)的花色苷Table 1 The most common anthocyanins

圖1 花色苷母核結(jié)構(gòu)Fig.1 Anthocyanin parent nucleus structure

花色苷3、5、7位上的羥基常通過(guò)糖苷鍵與糖結(jié)合，因糖的種類（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等）、數(shù)量（單糖、二糖、三糖等）、位置（3-單糖苷、5-雙糖苷、3，5-二糖苷等）及結(jié)合于糖殘基上芳香酸或脂肪酸的數(shù)目和性質(zhì)等不同，會(huì)衍生出多種花色苷類化合物[6]。

釀酒葡萄的花色苷穩(wěn)定性較差，溫度、SO2濃度、光照和pH值等因素均可影響其結(jié)構(gòu)和組成改變，相應(yīng)的生物活性也將隨之改變。適宜濃度的SO2處理對(duì)花色苷有保護(hù)作用，可減緩花色苷的褪色[8-9]。本文研究美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭3種釀酒葡萄的花色苷種類及穩(wěn)定性，為釀造優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭：中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷（色譜級(jí)）：上海寶曼生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜級(jí)）：美國(guó)fisher有限公司；甲酸（分析純）：天津永大化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；95%乙醇（分析純）：新宇三陽(yáng)實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器與設(shè)備見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備Table 2 Experimental instruments and equipment

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷溶液的制備

新鮮葡萄（或冷凍葡萄解凍）→打漿→乙醇提取[葡萄漿 ∶60%乙醇溶液=1∶18（g/mL），50℃浸提3 h]→50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇→花色苷粗提液→避光保存

1.3.2 花色苷粉末的制備工藝

花色苷粗提液→真空冷凍干燥（冷阱溫度-80℃，干燥24h）→花色苷凍干粉→密封于2mL試管→-20℃保存

1.3.3 總花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法[10-12]，吸取果汁1mL，分別加入12mL pH 1.0的緩沖溶液、12 mL pH 4.5的緩沖溶液，避光放置15 min，在520 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算總花色苷含量。

式中：X 為總花色苷含量，mg/L；A 為（A20-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；M為3-葡萄糖苷-矢車菊素的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；ε為摩爾消光系數(shù)，26900 L/（mol·cm）。

1.3.4 花色苷種類和含量的測(cè)定

超高壓液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)3種葡萄樣品60%乙醇提取后的花色苷溶液中的花色苷種類和含量。

質(zhì)譜檢測(cè)（mass-spectrometric detection，MSD）參數(shù)為ESI離子源，負(fù)離子模式（花色苷正離子模式）；掃描模式：全自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜掃描；霧化器壓力：15 psi（1 psi=6.895 kPa）；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；離子掃描范圍（m/z）：100～1 000。分離柱為Agilent C18，2.1×50 mm，1.8μm，柱溫45℃，進(jìn)樣量 3 μL。流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液，D為乙腈，流速0.3 mL/min。洗脫程序見(jiàn)表3。

表3 花色苷洗脫程序Table 3 Anthocyanin elution procedure

1.3.5 花色苷的穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.5.1 pH值對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

參考江瀾[13]、李雨浩等[14]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確稱取美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭3種釀酒葡萄花色苷凍干粉5 mg于5 mL水中，制成1 mg/mL的花色苷水溶液，用0.05 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl調(diào)花色苷水溶液的pH 值為 2、3、4、5、6、7，搖勻，室溫（25 ℃）避光放置2 h，觀察不同pH值下溶液的顏色變化，同時(shí)用色彩色差計(jì)測(cè)定溶液的亮度（lightness，L）、色度（chroma，C）、總色差（total color difference，TCD）值[15]，試驗(yàn)設(shè) 3個(gè)平行。

1.3.5.2 溫度對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

參考趙慧[16]的方法，稍作修改。將花色苷水溶液分別置于 4、25、55、75、100 ℃環(huán)境，保鮮膜封口加熱 3 h，每隔1 h測(cè)定一次，取樣時(shí)迅速冷卻至室溫（25℃），用色彩色差計(jì)測(cè)定不同溫度下花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.3.5.3 光照對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

參照劉芳芳等[17]的方法，稍作修改。將pH值2～4的花色苷水溶液置于白色玻璃瓶?jī)?nèi)，保鮮膜封口，分別放置于避光、日光燈加自然光（統(tǒng)稱為自然光）、室溫（25℃）超凈臺(tái)紫外燈下，觀察7 d，每天固定時(shí)間用色彩色差計(jì)測(cè)定不同光處理下花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.3.5.4 SO2添加量對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

參照張珍珍等[18]的方法，稍作修改。將50 g/L的SO2溶液，按照濃度為 30、40、50、60、70（mg/L），分別加入到美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭葡萄的花色苷水溶液中，混勻避光靜置24 h，用色彩色差計(jì)測(cè)定花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)操作3次。重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2010計(jì)算得出，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種釀酒葡萄的總花色苷含量

3種釀酒葡萄的花色苷含量見(jiàn)表4。

表4 美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭的總花色苷含量Table 4 Anthocyanin content of Merlot，Cabernet Sauvignon and Marselan

由表4可知，擠汁未經(jīng)醇提的釀酒葡萄花色苷含量為赤霞珠＞馬瑟蘭＞美樂(lè)，與醇提相比花色苷含量偏低，說(shuō)明有大量花色苷仍殘留在葡萄皮中。醇提后3種釀酒葡萄花色苷的含量為馬瑟蘭＞赤霞珠＞美樂(lè)，說(shuō)明釀酒葡萄果皮中花色苷的溶解性不同。

2.2 3種釀酒葡萄的不同花色苷種類及含量

3種釀酒葡萄的不同花色苷種類及含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 美樂(lè)、赤霞珠、馬瑟蘭3種釀酒葡萄的花色苷種類Table 5 Anthocyanin species of Merlot，Cabernet Sauvignon and Marselan three wine grapes

花色苷是葡萄果皮中呈色的主要物質(zhì)[19-21]，主要存在于紫色或紅色葡萄的果皮中。由表5可知，3種釀酒葡萄分別檢測(cè)到11、12、11種花色苷物質(zhì)，共同含有8種花色苷類物質(zhì)；赤霞珠和馬瑟蘭葡萄均未檢測(cè)到花葵素-3-蕓香糖苷，美樂(lè)和馬瑟蘭葡萄均未檢測(cè)出花葵素-3-半乳糖苷，甲基花青素-3-阿拉伯糖苷僅在美樂(lè)中未檢測(cè)出；在檢出的花色苷中，3′，5′-二甲花翠素葡萄糖苷含量占總花色苷含量的50%以上，而且二甲花翠素類所占比例最高[22]，花青素類所占比例最低；3種釀酒葡萄以花翠素、二甲花翠素、甲基花青素為主要花色苷。一些研究者認(rèn)為花青素是其他花色苷合成的前體物質(zhì)[23]，3種釀酒葡萄的花色苷含量依次是赤霞珠＞馬瑟蘭＞美樂(lè)，這與楊曉慧等[19]、ANA 等[24]、張娟等[25]的報(bào)道一致。

2.3 3種釀酒葡萄花色苷的穩(wěn)定性

2.3.1 pH值對(duì)3種葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響

pH值影響花色苷結(jié)構(gòu)的改變，pH值≤3時(shí)，花色苷以紅色吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)存在，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；花色苷結(jié)構(gòu)在pH 4～5時(shí)是不穩(wěn)定的，化學(xué)結(jié)構(gòu)很容易改變。pH值對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)3種釀酒葡萄的花色苷穩(wěn)定性影響Fig.2 Effect of pH on anthocyanin stability of three kinds of wine grapes

如圖2所示，pH值對(duì)3種釀酒葡萄花色苷的穩(wěn)定性影響很大，甚至改變了花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。花色苷溶液色澤越深，亮度（L）越小，色度（C）越大，總色差（TCD）越大。圖2中3種葡萄的L值隨pH值的提高先增加后下降，C值隨pH值的增加而下降，TCD值隨pH值的增加而增加。當(dāng)pH值≤3時(shí)，3種釀酒葡萄花色苷的L值呈上升趨勢(shì)，C值呈下降趨勢(shì)，TCD值的增加幅度高于pH值≥4的增加幅度。pH值>5后，花色苷的L值逐漸下降。因此，花色苷在較低pH值下是穩(wěn)定的，在較高的pH值條件下是不穩(wěn)定的。這與文獻(xiàn)[26]研究的結(jié)果一致。

2.3.2 光照對(duì)3種葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響

光照對(duì)花色苷有一定的降解效果，長(zhǎng)時(shí)間的光照會(huì)造成花色苷的大量損失，而且不同的光照處理對(duì)于花色苷的影響也不同。光照對(duì)3種葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 光照處理對(duì)3種釀酒葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light treatment on stability of anthocyanins in three wine grapes

由圖3可知，隨光處理時(shí)間的延長(zhǎng)，L值、C值呈下降趨勢(shì)，TCD值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。光處理第3天，花色苷溶液出現(xiàn)明顯的褪色現(xiàn)象，自然光和紫外線處理的花色苷溶液先出現(xiàn)白色和其他絮狀物；光處理第5天后，花色苷溶液明顯變淺，說(shuō)明花色苷在長(zhǎng)時(shí)間光照處理下是極其不穩(wěn)定的。

采用3種光處理赤霞珠、美樂(lè)、馬瑟蘭釀酒葡萄花色苷，馬瑟蘭葡萄的花色苷穩(wěn)定性強(qiáng)于美樂(lè)，赤霞珠葡萄穩(wěn)定性相對(duì)較弱。避光處理3種葡萄花色苷的L值下降速度低于紫外光和自然光。相同時(shí)間內(nèi)，避光處理的花色苷含量高于紫外和自然光的花色苷含量，避光花色苷的TCD值高于紫外光和自然光。可能是因?yàn)榛ㄉ赵诠庹諚l件下?；撀洌瑢?dǎo)致穩(wěn)定性下降。長(zhǎng)時(shí)間的光照處理會(huì)影響花色苷，時(shí)間越長(zhǎng)，花色苷降解越多，花色苷含量越低，溶液顏色越淺，這說(shuō)明紫外光照和自然光照對(duì)花色苷有強(qiáng)降解作用，這與Azuma等[27]的研究結(jié)論相似。

綜上所述，由圖3可知，馬瑟蘭葡萄花色苷穩(wěn)定性高于赤霞珠和美樂(lè)，避光環(huán)境比光照環(huán)境更利于花色苷水溶液的穩(wěn)定。

2.3.3 儲(chǔ)藏溫度對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果

花色苷的熱降解規(guī)律符合第一熱力學(xué)公式，在加熱時(shí)間延長(zhǎng)、溫度升高的情況下花色苷的降解速率也隨之加快。儲(chǔ)藏溫度對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著儲(chǔ)藏溫度的升高，葡萄花色苷的L值和TCD值上升，C值下降，顏色變淺。在4℃和25℃的較低溫度下，3種釀酒葡萄花色苷溶液的L值、C值、TCD值基本無(wú)變化；50℃時(shí)，發(fā)生略微變化；而在75℃時(shí)，相對(duì)于較低溫度都發(fā)生顯著性變化?？梢?jiàn)溫度提高，影響葡萄花色苷溶液的穩(wěn)定性。75℃以下，花色苷具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，隨溫度升高，耐熱性逐漸降低，這是由于在高溫下花色苷易氧化褪色[28]，還可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致部分色素復(fù)合物的解離，從而產(chǎn)生無(wú)色化合物，導(dǎo)致顏色喪失。較高的溫度可能會(huì)使花色苷的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，花色苷上的基團(tuán)和單體會(huì)發(fā)生位移[15，29]。因此，儲(chǔ)藏溫度需不超過(guò)50℃。

圖4 儲(chǔ)藏溫度對(duì)3種釀酒葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of storage temperature on stability of three wine grapes anthocyanins

2.3.4 SO2濃度對(duì)釀酒葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響

當(dāng)還原劑濃度較大時(shí)可嚴(yán)重破壞花色苷結(jié)構(gòu)。SO2還原性強(qiáng)，SO2在常溫下就能表現(xiàn)出強(qiáng)氧化性，破壞花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使花色苷褪色。SO2濃度對(duì)釀酒葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，馬瑟蘭葡萄的花色苷穩(wěn)定性強(qiáng)于美樂(lè)和赤霞珠。隨SO2濃度增加，花色苷溶液的L值逐漸增加，C值和TCD值逐漸下降。高濃度SO2對(duì)花色苷的穩(wěn)定性有一定的破壞作用；且當(dāng)SO2濃度升高時(shí)，花色苷與硫酸氫根離子發(fā)生縮合反應(yīng)使葡萄顏色衰退。并且由于SO2具有強(qiáng)還原性，因此氧化脫色的能力也隨之而來(lái)。SO2濃度≤40 mg/L時(shí)，3種釀酒葡萄的花色苷溶液顏色基本上保持紅色，無(wú)變化。SO2濃度過(guò)低，則抑制和殺菌能力不能發(fā)揮，因此建議SO2濃度≤40 mg/L比較合適。

圖5 SO2濃度對(duì)3種葡萄花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of SO2concentration on the stability of anthocyanins in three wine grapes

3 結(jié)論

花色苷是釀酒葡萄和所釀酒的重要功能指標(biāo)，其自身結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定無(wú)疑直接影響著產(chǎn)品的感官、營(yíng)養(yǎng)、安全性和功能性。本文通過(guò)超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定了赤霞珠、美樂(lè)和馬瑟蘭3種釀酒葡萄花色苷的種類及含量，其共同含有8種花色苷，赤霞珠含花色苷種類最多為12種，美樂(lè)和馬瑟蘭含花色苷種類為11種；3′，5′-二甲花翠素葡萄糖苷含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，3種釀酒葡萄均以花翠素、二甲花翠素、甲基花青素為主，含量依次為：赤霞珠>馬瑟蘭>美樂(lè)。溫度、SO2濃度、光照和pH值等因素影響花色苷穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)和組成會(huì)發(fā)生改變，相應(yīng)的生物活性也將隨之改變。適宜濃度的SO2對(duì)花色苷有保護(hù)作用，可減緩?fù)噬?。維持pH值≤3和SO2濃度≤40 mg/L，且在溫度低于50℃下避光保存，花色苷較穩(wěn)定，C6-C3-C6結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變化。