陳 瓊，陳 朋，李俊穎，崔紹華，喬 倩

（仙樂健康科技股份有限公司，廣東汕頭 515041）

兒童由于免疫系統(tǒng)不成熟，通常會比成年人更容易受到微生物的感染和引發(fā)更嚴重的疾病[1]，據(jù)報道，呼吸道感染疾病常發(fā)于5 歲以下兒童[2-3]。因此提高兒童的免疫力，增強兒童對感染性疾病的抵抗能力，有助于兒童的健康成長。

β-葡聚糖是由葡萄糖分子構(gòu)成的多糖類化合物，是真菌、酵母、一些細菌和燕麥、大麥等谷物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分[4]。其中酵母β-葡聚糖是首個被發(fā)現(xiàn)具有免疫增強作用的葡聚糖[5]，被公認是一個潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，同時對先天免疫和適應(yīng)性免疫有加強作用。動物體內(nèi)不存在β-葡聚糖，因此β-葡聚糖會觸發(fā)人體的免疫響應(yīng)，包括促進吞噬作用和細胞因子的產(chǎn)生，從而增強機體消除感染因子的能力[6]；同時有研究表明β-葡聚糖可以增強T 細胞刺激能力，進而促進相關(guān)細胞因子的分泌，增強適應(yīng)性免疫能力[7]。鋅為兒童生長發(fā)育的必要營養(yǎng)素，對于免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫功能有一定的促進作用。鋅是中樞免疫器官發(fā)育，免疫細胞及免疫因子發(fā)揮正常免疫功能的保持所必須的必要元素之一，它通過干預(yù)胸腺的成熟發(fā)育，細胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄來參與免疫過程[8]，缺乏鋅可能會導(dǎo)致巨噬細胞殺害胞內(nèi)寄生物的能力以及Th 淋巴細胞和NK 細胞的活性降低，從而影響T 細胞免疫功能[9]。

目前，關(guān)于酵母β-葡聚糖和鋅二者的復(fù)合配方研究主要為體外細胞實驗或以魚為研究模型[10-12]，對于酵母β-葡聚糖或鋅免疫調(diào)節(jié)功能的研究也多用成年鼠作為研究對象[13-14]，隨著小鼠周齡數(shù)增長，其免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能會發(fā)生改變，例如出現(xiàn)結(jié)構(gòu)退化、功能減退等[15]，因此酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對成年鼠的研究結(jié)果無法客觀反映其對幼年鼠免疫功能的影響。為了解二者組合對生長發(fā)育期免疫系統(tǒng)的影響，本試驗擬用幼齡小鼠，并以環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫低下模型，在此基礎(chǔ)上以酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對其進行干預(yù)，旨在于探究酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方是否可以逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的幼齡小鼠免疫抑制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級BALB/c 幼鼠（3 周齡）48 只，體重（13.52±2.06）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號No.44007200058759 廣東省醫(yī)學實驗動物中心；酵母β-葡聚糖 湖北安琪酵母有限公司；檸檬酸鋅 鄭州瑞普生物工程有限公司；小鼠IL-2、TNF-α、IFN-γ、SIgA 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血 南京茂捷微生物科技有限公司；水楊酸緩沖液 武漢百浩天生物科技有限公司。

JJ3000 型動物電子秤 美國G&G 公司；Cellometer Mini 型自動細胞計數(shù)儀 美國Nexcelom 公司；5424型小型高速離心機 德國Eppendorf 公司；Varioskan Flash 型全波長多功能酶標儀 美國Thermo 公司；Cytomics FC500MPL 流式細胞儀 美國Beckman Coulter 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 分組：將所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分成空白組、模型組及復(fù)合物組，每組各16 只，雌雄各半。復(fù)合物組劑量參考人群實驗所用劑量進行設(shè)計，給予酵母β-葡聚糖和鋅復(fù)合配方（相當于酵母β-葡聚糖：90 mg/kg/d、鋅：2.8 mg/kg/d），酵母β-葡聚糖和鋅（來源于檸檬酸鋅）用等量遞增法進行混合均勻，模型組與空白組給予等體積蒸餾水，每日灌胃1 次，實驗周期為4 周（28 d）。實驗期間，溫度恒定、通風，所有小鼠自由飲食、飲水。在給藥的第14、15 d 對模型組和復(fù)合物組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg 以造小鼠免疫抑制模型。試驗第29 d，將各組小鼠再次分為兩組（每組8 只，雌雄各半）：第Ⅰ組小鼠用于體重與免疫器官質(zhì)量測定、白細胞和淋巴細胞計數(shù)、細胞因子含量測定、脾淋巴細胞活性與NK 細胞活性測定、派氏結(jié)數(shù)目計數(shù)與SIgA 含量測定實驗、小腸形態(tài)學觀察；第Ⅱ組小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）綿羊血紅細胞（Sporeshaped Red Blood Cell,SRBC），并于4 d 后（即第33 d）用于溶血空斑試驗與血清溶血素測定。

1.2.2 小鼠體重與免疫器官質(zhì)量測定 實驗前將第I 組小鼠進行稱重并記錄，最后一次給藥24 h 后對每只小鼠稱重并記錄，進行取血，完整解剖摘取脾臟、胸腺，去除脂肪和筋膜組織后稱重，根據(jù)臟器指數(shù)計算公式計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)計算公式：臟器指數(shù)（g/g）=臟器質(zhì)量（g）× 100/體重（g）

1.2.3 小鼠白細胞和淋巴細胞計數(shù) 取第Ⅰ組小鼠血液，用全自動血細胞分析儀檢測白細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)。

1.2.4 細胞因子含量測定 取第I 組小鼠全血在4 ℃7500 r/min 離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書方法檢測血清IL-2、TNF-α 及IFN-γ 含量。

1.2.5 溶血空斑試驗與血清溶血素測定 參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[16]中方法取第II 組小鼠脾細胞進行溶血空斑試驗，取第II 組小鼠血清進行血清溶血素半數(shù)溶血值HC50測定。

1.2.6 小鼠脾淋巴細胞活性與NK 細胞活性測定參考徐榮[17]實驗方法，無菌取第I 組小組脾臟，制備脾細胞懸液；脾淋巴細胞活性應(yīng)用ConA 刺激脾淋巴細胞分化增殖，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定；NK 細胞活性采用乳酸脫氫酶（LDH）法測定。

1.2.7 小鼠派氏結(jié)數(shù)目計數(shù)與SIgA 含量測定 取第Ⅰ組小鼠全段小腸，計數(shù)小腸派氏結(jié)的個數(shù)。再取出靠近十二指腸段的空腸約5 cm，刮取腸黏膜內(nèi)容物，溶于PBS 溶液中，按試劑盒說明書方法測定SIgA含量。

1.2.8 小鼠小腸形態(tài)學觀察 取第I 組小鼠小腸空腸段置于10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋后制作切片，進行HE 染色，光鏡下觀察并拍照，測量小腸絨毛高度、隱窩深度，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值，計數(shù)每張切片每100 個腸黏膜柱狀上皮細胞間的杯狀細胞數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以均值±標準差表示，并應(yīng)用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學分析，總體均值的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊性時，組間比較采用LSD 法檢驗，方差不齊時需對原始數(shù)據(jù)做函數(shù)變換使各組達到方差齊性后再用LSD 法進行組間比較，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠體重及免疫器官系數(shù)的影響

如圖1 所示，三組間的初始體重沒有差異，最終體重也沒有差異（圖1a ）。與空白組相比（圖1b、圖1c），模型組經(jīng)過腹腔注射環(huán)磷酰胺后，脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），胸腺系數(shù)極顯著降低（P＜0.01），說明環(huán)磷酰胺成功誘導(dǎo)了幼年小鼠的免疫器官發(fā)育缺陷。復(fù)合物組小鼠在被給予酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方后，與模型組相比，脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)都顯著升高（P＜0.05），結(jié)果說明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的幼齡小鼠免疫器官發(fā)育缺陷，這與汪巖等實驗結(jié)果相一致[18]。

圖1 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠體重及臟器系數(shù)的影響（Mean±SD，n=8）Fig.1 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on body weight and viscera coefficient in immature mice

2.2 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠白細胞及淋巴細胞的影響

如圖2 所示，與空白組相比，模型組小鼠白細胞數(shù)和淋巴細胞比例均下降，但二者均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型組相比，復(fù)合物組小鼠在被給予酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方后白細胞數(shù)極顯著性提高（P＜0.01），淋巴細胞比例顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠有效提高由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制幼齡小鼠白細胞數(shù)和淋巴細胞比例。

圖2 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠白細胞數(shù)及淋巴細胞比例的影響（Mean±SD，n=8）Fig.2 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on number of white blood cells and lymphocyte ratio in immature mice

2.3 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠血清細胞因子的影響

IL-2 濃度升高可激活Th2 細胞，提高機體的體液免疫應(yīng)答[19]；IFN-γ則可通過活化Th1 細胞，提高機體細胞免疫效能[20]，TNF-α是由巨噬細胞被激活而產(chǎn)生的，其能提高巨噬細胞的吞噬活性[21]。如圖3 所示，與空白組相比，模型組血清中IL-2、TNFα和IFN-γ含量均下降，其中TNF-α（圖3b ）、IFNγ（圖3c ）的含量極顯著降低（P＜0.01），IL-2（圖3a ）含量顯著降低（P＜0.05）。復(fù)合物組小鼠血清IL-2、TNF-α 和IFN-γ 含量有不同程度的提高，與模型組相比，IL-2 含量上升，但未見顯著性，而 TNF-α和IFN-γ含量均極顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的幼齡小鼠細胞因子分泌減少，其中對抑制TNF-α和IFN-γ的減少尤為顯著（P＜0.01）。

圖3 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠血清IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的影響（Mean±SD，n=8）Fig.3 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on contents of IL-2,TNF-α and IFN-γ in serum of immature mice

2.4 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠血清溶血素HC50 及溶血空斑數(shù)的影響

血清溶血素HC50和溶血空斑數(shù)是常用于衡量生物體體液免疫功能的指標[16]。如圖4 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清溶血素HC50、溶血空斑數(shù)均極顯著降低（P＜0.01）。復(fù)合物組小鼠血清溶血素HC50及溶血空斑數(shù)與模型組相比均得到提高，且具極顯著性（P＜0.01），與空白組相比無顯著性變化（P＞0.05）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠有效抑制環(huán)磷酰胺引起的免疫低下幼齡小鼠的血清溶血素水平和溶血空斑數(shù)的減少。

圖4 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠血清溶血素HC50 及溶血空斑數(shù)的影響（Mean±SD，n=8）Fig.4 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on serum hemolysin HC50 and number of hemolytic plaques in immature mice

2.5 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠脾淋巴細胞增殖能力及NK 細胞活性的影響

如圖5 所示，與空白組相比，模型組脾淋巴細胞增殖活性（圖5a ）、NK 細胞活性（圖5b ）均極顯著降低（P＜0.01）。復(fù)合物組小鼠脾淋巴細胞增殖活性、NK 細胞活性與模型組相比均得到提升，其中淋巴細胞增殖活性顯著提高（P＜0.05），NK 細胞活性極顯著提高（P＜0.01）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺引起幼齡小鼠的脾淋巴細胞和NK 細胞的活性降低。

圖5 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠脾淋巴細胞增殖能力及NK 細胞活性的影響（Mean±SD，n=8）Fig.5 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on proliferation ability of splenic lymphocytes and NK cell activity in immature mice

2.6 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠小腸SIgA含量及小腸派氏結(jié)數(shù)量的影響

SIgA 是腸道黏膜免疫的功能指標，通過產(chǎn)生抗體與抗原特異性結(jié)合，抑制病原微生物的黏附功能。派式結(jié)是腸道B 細胞的生發(fā)中心，生成分泌型IgA（SIgA）[22]。如圖6 所示，與空白組相比，模型組小鼠小腸SIgA（圖6a）分泌的含量極顯著降低(P＜0.01)，派氏結(jié)數(shù)目（圖6b）顯著減少（P＜0.05），提示環(huán)磷酰胺成功誘導(dǎo)了腸道免疫功能障礙。與模型組相比，復(fù)合物組小鼠小腸SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），派氏結(jié)數(shù)也極顯著增多（P＜0.01）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的幼齡小鼠小腸SIgA 含量降低以及派氏結(jié)數(shù)量減少。

圖6 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠小腸SIgA 含量及小腸派氏結(jié)數(shù)量的影響（Mean±SD，n=8）Fig.6 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on the content of SIgA and the number of PPs in small intestine of immature mice

2.7 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠腸道黏膜形態(tài)的影響

杯狀細胞分泌腸道中黏蛋白[23]，隱窩深淺，可以側(cè)面體現(xiàn)小腸上皮細胞成熟率，分泌、吸收等腸細胞功能[24]。如圖7 所示，與空白組相比，模型組小腸絨毛高度（圖7a）、隱窩深度（圖7b）、絨毛高度/隱窩深度（圖7c）、杯狀細胞數(shù)量（圖7d）的均無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組相比，復(fù)合物組小鼠小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度比值無顯著差異，而隱窩深度顯著性降低（P＜0.05）、杯狀細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠顯著（P＜0.05）增加幼齡小鼠小腸杯狀細胞數(shù)量，并且有效（P＜0.05）減少小鼠小腸隱窩深度。

圖7 酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方對幼齡小鼠絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度及杯狀細胞數(shù)的影響（M±SD，n=8）Fig.7 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on villus height,crypt depth,villus height/crypt depth,and the number of goblet cells in small intestine of immature mice

3 討論與結(jié)論

本研究中，模型組小鼠免疫器官指數(shù)、白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、NK 細胞活性和免疫相關(guān)細胞因子均顯著（P＜0.05）低于空白組，表明本研究成功地用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)了幼齡小鼠的免疫抑制。然而，攝取β-葡聚糖和鋅復(fù)合配方的小鼠，經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，免疫器官指數(shù)、外周血中白細胞和淋巴細胞比例，淋巴細胞增殖活性顯示均顯著（P＜0.05）高于模型組小鼠，提示酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方能夠逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠免疫器官缺陷和免疫細胞減少。

T 細胞是一種重要的免疫細胞，分化成熟后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)分布至外周免疫器官。其中輔助型T 細胞（Th1 和Th2）分泌的不同類型的細胞因子是決定細胞功能的重要因素，主要表現(xiàn)為Th1 細胞調(diào)節(jié)機體細胞免疫功能，Th2 細胞參與體液免疫應(yīng)答。環(huán)磷酰胺可以通過使Th1/Th2 發(fā)生細胞偏倚，誘導(dǎo)免疫抑制[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2 分泌細胞因子（IL-2、IFN-γ）在攝取酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方條件下獲得顯著（P＜0.05）上調(diào)，此結(jié)果與Bakheet 的研究結(jié)果一致[26]。在后續(xù)研究中，建議將通過細胞流式技術(shù)檢測Th1、Th2 細胞數(shù)量，確認Th1/Th2 細胞比值。

除了輔助型T 細胞以外，巨噬細胞和NK 細胞是參與殺傷腫瘤細胞的兩種主要效應(yīng)細胞，巨噬細胞和NK 細胞被細胞因子和趨化因子激活，在調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及去除病毒中發(fā)揮核心作用[27-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)NK 細胞活性下降以及巨噬細胞分泌細胞因子（TNF-α）濃度減少。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體最大，也是相對獨立的免疫系統(tǒng)，是機體對抗病原體感染的第 一層屏障，同時，也在維護宿主與外環(huán)境間的黏膜穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。有報道證明以成年小鼠為研究對象酵母β-葡聚糖可提高SIgA 含量[4]，而鋅通過調(diào)控小腸上皮細胞，宿主免疫細胞等來維持小腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，是保持適當腸黏膜厚度的基礎(chǔ)[29]，本研究結(jié)果首次證明了，以幼齡小鼠為實驗對象，酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合物可以通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方可以通過逆轉(zhuǎn)免疫器官缺陷，提高免疫細胞數(shù)量，同時增強特異性免疫和非特異性免疫，提高腸道黏膜免疫，來逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的幼齡小鼠免疫抑制現(xiàn)象，證明β-葡聚糖加鋅復(fù)合配方具有較好的調(diào)節(jié)幼齡小鼠免疫機能的作用。