WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系*

馮硯平，王 楠，王偉佳

廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病是一類(lèi)高度異質(zhì)性疾病，主要特征為髓系原始細(xì)胞克隆性惡性增殖，危害較大，病死率較高?；驒z測(cè)有助于預(yù)防、避免重大疾病的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)個(gè)體基因缺陷，制訂臨床治療方案[1-2]。Wilms基因(WT1基因)最早在Wilms瘤中被發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量約為50×103，位于人類(lèi)染色體11p13，與瘤體病變密切相關(guān)。WT1基因在白血病中有較高水平的表達(dá)，被稱(chēng)為“泛白血病”基因標(biāo)志，與白血病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后均密切相關(guān)[3]；裸角質(zhì)膜同源蛋白(NKD1)基因?qū)儆赪nt/β-Catenin信號(hào)通路抑制物，與腫瘤細(xì)胞的多項(xiàng)生物學(xué)功能有關(guān)，也能在正常組織中表達(dá)，但表達(dá)水平較低[4]。本研究分析了WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表達(dá)情況，旨在探討WT1、NKD1基因表達(dá)與急性髓系白血病預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年2月至2019年6月本院收治的100例急性髓系白血病患者納入研究作為觀察組，患者均符合《成人急性髓系白血病中國(guó)診療指南(2017年版)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)。觀察組患者年齡35～72歲，平均(51.68±12.14)歲；男性46例，女性54例；FAB分型：16例M1型，28例M2型，24例M3型，22例M4型，10例M5型；ET0分型：15例突變型，85例野生型；核型：65例t(15；17)型，35例t(8；21)型。另外，選取同期于本院治療的造血系統(tǒng)非惡性腫瘤(缺鐵性貧血)患者100例作為對(duì)照組。對(duì)照組患者年齡34～71歲，平均(51.49±12.13)歲；男性47例，女性53例。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入研究的患者均同意接受12個(gè)月隨訪，依從性、配合度較高，已簽署書(shū)面知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：溝通、交流障礙者；合并惡性腫瘤，預(yù)計(jì)生存時(shí)間≤1個(gè)月者。

1.2方法

1.2.1WT1的檢測(cè)及分析 (1)抽取受檢者2 mL抗凝骨髓液，分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗2遍，吹打懸浮(運(yùn)用適量PBS)，抽取0.5 mL浸泡于Trizol中搖勻，放于冰箱(-80 ℃)內(nèi)保存；制作2張骨髓涂片。(2)將提取成功的單個(gè)核細(xì)胞總RNA放入冰箱內(nèi)(-80 ℃)保存。(3)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：按照說(shuō)明書(shū)配制cDNA反應(yīng)體系20 μL，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL；WT1基因表達(dá)水平以WT1與GAPDH灰度值的比值表示。

1.2.2NKD1的檢測(cè)及分析 使用美國(guó)ABI公司7300型號(hào)熒光定量擴(kuò)增儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)，反應(yīng)體系的配制、反應(yīng)條件、引物設(shè)計(jì)、基因相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.3治療方法 對(duì)于確診的急性髓系白血病患者，采用柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷方案(DA方案)進(jìn)行化療，第1～3天靜脈滴注45 mg/m2柔紅霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字H33020925，瀚暉制藥有限公司)或8 mg/m2去甲氧柔紅霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字H20050145，瀚暉制藥有限公司)，第1～7天靜脈滴注150 mg/m2阿糖胞苷(國(guó)藥準(zhǔn)字H23021805，國(guó)藥一心制藥有限公司)。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組NKD1、WT1基因表達(dá)情況；分析不同性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者WT1和NKD1基因表達(dá)情況；使用受試者操作特征曲線(ROC曲線)分析WT1、NKD1基因用于急性髓系白血病診斷的價(jià)值；對(duì)急性髓系白血病患者進(jìn)行12個(gè)月隨訪，統(tǒng)計(jì)患者12個(gè)月內(nèi)的生存率以及隨訪期間平均生存時(shí)間，同時(shí)分別統(tǒng)計(jì)NKD1、WT1基因不同表達(dá)程度(高表達(dá)和正常表達(dá))患者的生存率和生存時(shí)間；分析WT1、NKD1基因表達(dá)與生存時(shí)間、生存率的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1兩組間基因表達(dá)情況的比較 觀察組WT1基因表達(dá)水平(1.13±0.19)高于對(duì)照組(0.06±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=56.238,P<0.001)；觀察組NKD1基因表達(dá)水平(0.86±0.15)高于對(duì)照組(0.04±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2不同臨床特征急性髓系白血病患者的WT1、NKD1基因表達(dá)水平 不同性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者間比較，WT1和NKD1基因表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達(dá)水平的比較

續(xù)表1 不同臨床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達(dá)水平的比較

2.3WT1、NKD1基因的診斷價(jià)值分析 WT1基因檢測(cè)以相對(duì)表達(dá)水平0.88作為診斷界值，>0.88標(biāo)記為高表達(dá)，觀察組100例患者中90例出現(xiàn)高表達(dá)。NKD1基因檢測(cè)以相對(duì)表達(dá)水平0.52作為診斷界值，>0.52標(biāo)記為高表達(dá)，觀察組100例患者中92例出現(xiàn)高表達(dá)。ROC曲線分析顯示，WT1基因檢測(cè)用于急性髓系白血病診斷的AUC為0.979，NKD1基因檢測(cè)的AUC為0.984，兩者均具有較高的診斷價(jià)值。見(jiàn)表2。

表2 WT1、NKD1基因檢測(cè)的ROC曲線分析

2.4患者生存率和生存時(shí)間的分析 觀察組100例患者接受化療干預(yù)后，總生存率為88.00%(88/100)，平均生存時(shí)間為(10.42±2.69)月。不同基因表達(dá)程度患者的生存率和生存時(shí)間見(jiàn)表3。

表3 對(duì)比不同基因表達(dá)情況的生存率和生存時(shí)間

2.5WT1、NKD1基因表達(dá)與急性髓系白血病患者生存時(shí)間、生存率的關(guān)系 WT1、NKD1基因表達(dá)水平與急性髓系白血病患者生存率無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但均與急性髓系白血病患者生存時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.417、0.492，P<0.001)，WT1基因和NKD1基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.643，P<0.001)。

3 討 論

急性髓系白血病是一類(lèi)高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)基因突變和細(xì)胞遺傳學(xué)情況，可分為3個(gè)危險(xiǎn)分層，為了準(zhǔn)確了解病變發(fā)生、發(fā)展情況，需注重臨床檢測(cè)工作，從而合理制訂治療方案[7-8]。WT1是一種抑癌基因，編碼產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子，最早從Wilms瘤細(xì)胞中分離出來(lái)，編碼的蛋白含鋅指狀多肽，在腫瘤患者骨髓和外周血中高表達(dá)，而在健康人群中僅存在微量表達(dá)或不表達(dá)[9-10]。本研究中，觀察組WT1基因表達(dá)水平高于對(duì)照組。

NKD1基因是Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的經(jīng)典抑制物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、分化、增殖等生物學(xué)過(guò)程，影響造血干細(xì)胞衰老過(guò)程，且可調(diào)控骨生長(zhǎng)和骨量生長(zhǎng)[6]。本研究中，觀察組NKD1基因表達(dá)水平高于對(duì)照組。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)異常時(shí)，NKD1基因表達(dá)上調(diào)，可直接激活靶基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞衰老、增殖、生長(zhǎng)等過(guò)程，NKD1基因表達(dá)上調(diào)可能參與了急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展。對(duì)比了不同臨床特征急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達(dá)情況，結(jié)果均無(wú)明顯差異。因?yàn)閃T1、NKD1基因僅受啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化調(diào)控影響，而性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型均不是其表達(dá)水平的影響因素[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)WT1、NKD1基因表達(dá)水平的檢測(cè)用于急性髓系白血病診斷均有較高價(jià)值，可作為輔助診斷的分子標(biāo)志物[12]，但由于本次樣本量較少，該結(jié)論還有待進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。

許晶等[13]報(bào)道，WT1基因與急性髓系白血病預(yù)后具有一定相關(guān)性。本研究中，WT1、NKD1基因表達(dá)水平均與急性髓系白血病患者生存時(shí)間呈正相關(guān)，說(shuō)明WT1、NKD1基因表達(dá)水平能夠一定程度地預(yù)測(cè)治療效果。WT1基因在急性髓系白血病患者中具有較高的表達(dá)水平，主要靶基因包括細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因、Wnt信號(hào)途徑基因、MAPK信號(hào)途徑基因等，參與細(xì)胞死亡、代謝、分化、生長(zhǎng)，故在急性髓系白血病患者發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中具有一定作用[14]。NKD1可抑制Wnt信號(hào)通路活化，是Wnt信號(hào)通路重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病變時(shí)，NKD1基因表達(dá)水平可明顯升高，與病變程度、預(yù)后相關(guān)[15]。

總而言之，WT1基因和NKD1基因表達(dá)水平呈正相關(guān)，可作為急性髓系白血病患者預(yù)后評(píng)判的重要指標(biāo)，且與患者生存時(shí)間呈正相關(guān)，可作為免疫治療的靶點(diǎn)。