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      基于miR-34a/SIRT1通路研究電針刺激對腦卒中大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用

      2021-06-22 11:17:04高國強(qiáng)馮亞男崔華峰
      中國老年學(xué)雜志 2021年12期
      關(guān)鍵詞:平衡木電針肌力

      高國強(qiáng) 馮亞男 崔華峰

      (1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院,山東 滕州 277599;2滕州市中醫(yī)醫(yī)院;3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科)

      腦卒中是臨床中常見的腦血管疾病,致殘率與致死率高,對神經(jīng)功能造成傷害,影響患者日后正常生活,有效促進(jìn)腦梗死患者神經(jīng)功能恢復(fù)是目前臨床亟待解決的問題〔1,2〕。電針刺激是指在刺入人體穴位的毫針上,用電針機(jī)通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。研究顯示電針刺激對神經(jīng)功能的恢復(fù)有幫助〔3〕,但其機(jī)制尚未完全清楚。SIRT1是最早在酵母中發(fā)現(xiàn)的一種可調(diào)控壽命基因,研究顯示其在神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi),miR-34a分子主要表達(dá)于腦組織,可調(diào)控SIRT1參與一系列生理病理活動(dòng)〔5〕。因此本研究構(gòu)建大鼠大腦動(dòng)脈閉塞模型,并基于miR-34a/SIRT1通路探討電針刺激對大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用并探討可能機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1材料 健康雄性SD大鼠50只,體重180~200 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,專用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、水喂養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號:SYXK(湘)2014-0012,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2014-0002。大鼠均于室內(nèi)通風(fēng)柜中飼養(yǎng),手術(shù)前1 d晚上禁食。環(huán)球牌針灸針(直徑0.25 mm,長度30 mm)購自豪嘉醫(yī)療器械專營店,華佗牌SDZ-Ⅱ型針灸治療儀購自重慶美樂醫(yī)療器械有限公司。Trizol試劑盒(12183555)、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(12574018)、蛋白提取試劑盒(AM1556)、BCA試劑盒(23227)購自賽默飛世爾中國公司;鼠抗人SIRT1抗體(ab17193)購自美國abcam公司;GAPDH(sc-47724)購自美國Santa Cruz公司。

      1.2方法

      1.2.1動(dòng)物分組、造模及處理 將大鼠分為正常組、模型組、假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組。除正常組外,均參照文獻(xiàn)〔6〕左側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓閉塞法制作,構(gòu)建腦卒中大鼠模型。在大鼠頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸動(dòng)脈,在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈,在頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口,將尼龍線(直徑0.2 mm)順勢緩慢插入大腦中動(dòng)脈,栓塞大腦中動(dòng)脈起始端的血流,然后以尼龍線結(jié)扎頸總動(dòng)脈。造模成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠蘇醒后右側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失;提尾倒懸時(shí)右上肢向胸前屈曲;行走時(shí)右側(cè)傾倒或向右轉(zhuǎn)圈;左側(cè)出現(xiàn)霍納征。排除標(biāo)準(zhǔn):造模不成功;中途死亡。模型制備成功后,將假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠固定,待大鼠安靜后,電針組于每天上午9∶00~11∶00對大鼠百會(huì)穴、大椎穴〔7〕進(jìn)行電針處理,頻率2 Hz,強(qiáng)度3 mA,時(shí)間20 min,刺激前經(jīng)行皮膚消毒,干涉21 d。假電針刺激組于每天上午9∶00~11∶00行假電針干涉21 d(僅將針插入穴位,不給予電刺激)。假穴位刺激組于每天上午9∶00~11∶00將電針插入穴位右側(cè)1 cm處,給予電刺激,同電針處理。

      1.2.2平衡木行走實(shí)驗(yàn)評分 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、14、21天分別測定運(yùn)動(dòng)整合及協(xié)調(diào)能力,平衡木長80 cm,寬2.5 cm,平放在距離地面高10 cm處,術(shù)前1 w每天早晚各訓(xùn)練1次,每次10 min,使其能順利在平衡木上行走,按Feeney 5級計(jì)分〔8〕標(biāo)準(zhǔn)0分,可正常穿過平衡木;1分,穿過平衡木,但小于一半的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象;2分,穿過平衡木,但有大于50%的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象;3分,可穿過平衡木,但癱瘓側(cè)后肢拖行;4分,無法穿過平衡木,但可在平衡木上保持平衡;5分,將大鼠放在平衡木上會(huì)掉下來。

      1.2.3抓握牽引試驗(yàn) 行電針刺激、假穴位電針刺激、電針刺激第1、3、7、14、21天分別進(jìn)行抓握牽引試驗(yàn),將直徑0.15 mm的鋼絲繩置于距離地面70 cm固定,下面放厚5 cm的海綿墊以防大鼠摔傷。將大鼠兩個(gè)前爪放鋼絲繩上,記錄大鼠懸掛時(shí)間〔9〕。0分,掛在繩上0~2 s;1分,掛在繩上3~4 s;2分,掛在繩上5 s;3分,掛在繩上超過5 s。

      1.2.4神經(jīng)功能缺損評分的監(jiān)測 末次刺激結(jié)束后,參照文獻(xiàn)方法評估大鼠神經(jīng)功能缺損評分〔10〕:0分,無神經(jīng)功能障礙;1分,右前爪無法充分外展;2分,走時(shí)向右轉(zhuǎn)圈;3分,行走時(shí)向右傾倒;4分,無法自主行走,出現(xiàn)意識障礙。

      1.2.5大鼠腦組織梗死比測量 各組大鼠末次刺激結(jié)束后,隨機(jī)抽取5只,快速斷頭取腦,冰凍20 min后去除小腦及低位腦干,從額極至枕極做2 mm連續(xù)冠狀切片,將切片置于2%的2,3,5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染液中,37℃避光育30 min,轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中固定,正常腦組織呈紅色,梗死區(qū)呈白色,用眼科鑷仔細(xì)分離白色區(qū)與紅色區(qū),參照文獻(xiàn)〔7〕方法分別稱重,計(jì)算梗死區(qū)占全腦的百分比作為梗死比〔11〕,梗死比(%)=白色區(qū)重量/(白色區(qū)重量+紅色區(qū)重量)/100%。剩余各組大鼠分離腦組織,一部分經(jīng)固定、脫水后石蠟包埋,連續(xù)切片4 μm,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化情況;另一部分儲(chǔ)存于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測血清miR-34a水平 按照Trizol試劑盒操作說明提取1.2.5液氮中腦組織標(biāo)本中總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Superscript Ⅲ將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real Master Mix試劑盒行qRT-PCR檢測miR-34a表達(dá)水平,PCR條件:95℃預(yù)熱10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-34a相對表達(dá)量。正向引物:5′-GGGAAUAGU-AGCUGUCAAATT-3′,反向引物:5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′;miR-34a正向引物:5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′,反向引物:5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

      1.2.7免疫印跡法檢測SIRT1蛋白表達(dá) 取1.2.5液氮中各組大鼠適量腦組織,RIPA裂解液裂解,充分裂解后4℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清液,BCA法測定蛋白含量。取一定量蛋白質(zhì),加入上樣緩沖液,95℃煮沸5 min,離心后取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后,將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶37℃封閉2 h。加入SIRT1一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,清洗PVDF膜后,加入二抗37℃孵育2 h,洗膜。加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液避光顯影。Image J圖像軟件測定各蛋白條帶的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)水平。

      1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

      2 結(jié) 果

      2.1各組平衡木試驗(yàn)評分比較 正常組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),模型組平衡木試驗(yàn)評分于術(shù)后3 d達(dá)最頂峰,隨后下降,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分依次降低;與正常組相比,模型組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分均顯著下降(P<0.05);假電針刺激組與假穴位電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比,電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)平衡木試驗(yàn)評分均顯著下降(P<0.05)。見表1。

      2.2各組肌力測驗(yàn)評分比較 正常組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),模型組肌力測驗(yàn)評分于術(shù)后3 d達(dá)最低谷,隨后上升;假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組術(shù)后1 d、3 d、14 d、21 d肌力測驗(yàn)評分依次升高。與正常組相比,模型組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分均顯著降低(P<0.05);與模型組相比,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分均顯著升高(P<0.05);與假電針刺激組相比,假穴位電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分均顯著升高(P<0.05);與假穴位電針刺激組相比,電針刺激組各時(shí)間點(diǎn)肌力測驗(yàn)評分均顯著升高(P<0.05)。見表2。

      表1 各組平衡木試驗(yàn)評分、腦組織神經(jīng)功能缺損評分及腦組織梗死比比較

      表2 各組肌力測驗(yàn)評分及腦組織miR-34a、SIRT1蛋白表達(dá)比較

      2.3各組神經(jīng)功能評分 正常組無神經(jīng)功能缺損。與模型組相比,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05);假電針刺激組與假穴位電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比,電針刺激組大鼠腦組織神經(jīng)功能缺損評分顯著下降(P<0.05)。見表1。

      2.4各組腦組織梗死比比較 正常組腦組織無梗死。與模型組相比,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織梗死比顯著降低(P<0.05);假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織梗死比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比,電針刺激組腦組織梗死比顯著下降。見表1。

      2.5各組腦組織病理學(xué)改變 正常組腦組織結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常,神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則。模型組腦組織結(jié)構(gòu)不清、組織疏松,神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,胞質(zhì)著色灰暗、胞核稍增大,染色深。假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組神經(jīng)細(xì)胞部分恢復(fù),且電針刺激組好于假電針刺激組與假穴位電針刺激組。見圖1。

      2.6各組腦組織miR-34a及SIRT1蛋白表達(dá) 與正常組相比,模型組腦組織miR-34a水平顯著升高(P<0.05),SIRT1蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,假電針刺激組、假穴位電針刺激組、電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05),SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);假電針刺激組與假穴位電針刺激組腦組織miR-34a、SIRT1蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與假電針刺激組、假穴位電針刺激組相比,電針刺激組腦組織miR-34a顯著降低(P<0.05),SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表2、圖2。

      箭頭代表神經(jīng)細(xì)胞圖1 各組腦組織病理切片(HE,×200)

      1~5:正常組,模型組,假電針刺激組,假穴位電針刺激組,電針刺激組圖2 各組腦組織SIRT1蛋白

      3 討 論

      電針刺激是中醫(yī)學(xué)中針灸的一種療法,具有針灸和電療的雙重特點(diǎn),其療效及安全性已經(jīng)過驗(yàn)證。普遍認(rèn)為針刺鎮(zhèn)痛是一個(gè)生理性調(diào)整過程,是痛覺傳入信號與穴位傳入在中樞神經(jīng)系統(tǒng)能相互作用的結(jié)果,神經(jīng)、體液因素在其中發(fā)揮重要作用〔12,13〕。研究顯示,通過對大鼠迷走神經(jīng)進(jìn)行電刺激可部分恢復(fù)大鼠中動(dòng)脈阻斷/再灌注損傷大鼠腦損傷〔14〕。Shi等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),電針刺激可改善缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)功能,減少腦梗體積,降低腦組織中的炎癥因子及興奮性氨基酸的水平,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示成功構(gòu)建腦卒中大鼠模型,電刺激、穴位刺激及電針刺激均對腦梗死大鼠神經(jīng)功能具有一定的恢復(fù)作用,而電針刺激療效遠(yuǎn)好于假電針刺激與假穴位電針刺激,提示電針刺激對保護(hù)動(dòng)脈閉塞大鼠神經(jīng)功能,部分恢復(fù)梗死比具有優(yōu)越性,這可能由于電針刺激具有改善神經(jīng)的傳導(dǎo)功能、促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)等功能,可改善神經(jīng)組織的微血管環(huán)境,能增加脊髓和外周神經(jīng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而提高患者痛閾、增加疼痛的耐受力、降低疼痛的敏感性〔16〕。

      miR-34a是位于染色體1p36,主要表達(dá)于腦組織〔17〕。周成芳等〔18〕研究顯示,大鼠腦缺血再灌注損傷模型中腦組織miR-34a水平異常升高。研究表明,SIRT1是miR-34a的靶蛋白,miR-34a可調(diào)控SIRT1參與阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔19〕。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙?;福哂醒泳徏?xì)胞衰老的作用〔5〕。近年來,SIRT1的神經(jīng)保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注,Carloni等〔20〕研究顯示,腦缺血再灌注損傷過程中,SIRT1可通過抑制p53和核因子(NF)-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡保護(hù)神經(jīng)損傷。趙秀芹等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),丁苯酚注射液通過上調(diào)SIRT1表達(dá)減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。本研究表明電針刺激顯著降低miR-34a,促進(jìn)SIRT1蛋白表達(dá),提示電針刺激可能通過協(xié)同激活miR-34a/SIRT1通路改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能。

      綜上所述,電針刺激可能通過激活miR-34a/SIRT1通路,促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù),本研究也存在一定不足,電針刺激恢復(fù)大鼠神經(jīng)功能的相關(guān)通路有待進(jìn)一步探討。

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