脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清液對體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

閆靜川，王洪濤，賈艷慧，白曉智，劉 洋，陳俏華

已有研究[1]顯示，脂肪間干細(xì)胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合與組織再生。ADSCs具有多項(xiàng)分化潛能，可轉(zhuǎn)分化為多種修復(fù)細(xì)胞直接參與創(chuàng)面修復(fù)；另一方面，ADSCs可能通過旁分泌各種生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子，調(diào)控創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而加速創(chuàng)面的愈合[2]，但具體機(jī)制尚不清楚。血管的發(fā)生是一個(gè)包含多種修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子以及機(jī)械力學(xué)、氧濃度等微環(huán)境因素參與的復(fù)雜過程，低氧環(huán)境誘導(dǎo)、機(jī)械牽張、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascular endothelial Growth Factor,VEGF）、血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ,AngⅠ）、炎性因子等均參與這一復(fù)雜過程[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為主要效應(yīng)細(xì)胞，增殖、遷移等生物學(xué)特性在血管發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。我們體外培養(yǎng)人ADSCs并收集培養(yǎng)上清液，作為條件培養(yǎng)基，觀察其對體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）生物學(xué)特性的影響，初步探討ADSCs通過旁分泌促進(jìn)血管發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 游離脂肪組織由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷外科提供，為全厚皮膚移植手術(shù)中修剪下廢棄的脂肪，經(jīng)患者同意后自愿捐贈。HUVECs購自美國模式培養(yǎng)物庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA購自美國GIBCO公司；Ⅰ型膠原酶、鼠抗人VEGF，AngⅠ抗體購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗鼠熒光標(biāo)記二抗、兔抗鼠酶聯(lián)標(biāo)記二抗，β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）。

1.2 ADSCs培養(yǎng)上清的收集 按照YAN LI[5]方法進(jìn)行ADSCs的培養(yǎng)。簡單步驟為，在無菌條件下將大塊的脂肪用含1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗三遍，后放入10 cm平皿中，剪成糜狀，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，充分混勻后置于37℃恒溫箱，100 rpm消化40 min-60 min。100目鋼絲濾網(wǎng)過濾去除沒有消化的雜質(zhì)，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，用含10%胎牛血清的人ADSCs專用培養(yǎng)基5 mL重懸細(xì)胞沉淀，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于孵箱常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)選取3-5代細(xì)胞，待細(xì)胞長至75%-85%融合度時(shí)，PBS沖洗，無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，收集上清備用，將上清與DMEM培養(yǎng)基按照1：1混合，并加入10%胎牛血清，作為實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)基，含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為對照組。

1.3 HUVECs的復(fù)蘇和傳代 HUVECs來從液氮中取出細(xì)胞凍存管，立即置于37℃細(xì)胞復(fù)蘇水浴鍋中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打混勻后1000 rpm離心3 min；棄去上清液后重懸，移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；待內(nèi)皮細(xì)胞生長接近融合時(shí)用0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。

1.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 使用MTT測定法檢測細(xì)胞增殖，將HUVECs按每孔1×104接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，分別向每個(gè)孔中加入20μL濃度為5 g/L的MTT并孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜并震蕩混勻15 min，490 nm波長酶聯(lián)免疫儀測取吸光度值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將HUVECs接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞80%鋪滿，PBS清洗2次，10μg/mL絲裂霉素37℃孵育1 h，用200μL吸頭在細(xì)胞培養(yǎng)孔中央垂直劃一直線，PBS清洗2次，分別加入實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)基，于劃痕后即刻、24 h、48 h顯微鏡拍照，每次拍照固定相同位置，測量各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算愈合速度，比較細(xì)胞遷移快慢。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室插入24孔板中，向小室中加入100μL HUVECs 1×104/孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。實(shí)驗(yàn)組下室更換為條件培養(yǎng)基，對照組下室更換為普通培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用棉簽刮去上室未遷移細(xì)胞，并將小室用多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞并計(jì)數(shù)，重復(fù)6次取平均值。

1.7 免疫熒光染色 將載玻片放入6孔培養(yǎng)板中，分別接種HUVECs 1×105個(gè)細(xì)胞/孔。待細(xì)胞70%融合后，PBS清洗2次，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加入條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%Triton/PBS室溫中處理15 min，甲醇新配置0.3%雙氧水室溫孵育15 min，5%BSA/PBS于37℃下封閉2 h，分別滴加1:100的鼠抗人一抗，4℃下孵育過夜，PBS洗滌×3次。1:50的Cy3標(biāo)記兔抗小鼠二抗，37℃下孵育1h，PBS洗滌×3次，DAPI室溫孵育30 min，PBS洗滌×3次，防熒光淬滅封片劑封片后，顯微鏡拍照。

1.8 Westernblot 不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下HU?VECs達(dá)到80%鋪滿時(shí)，RIPA強(qiáng)細(xì)胞裂解液作用30 min，后取上清液進(jìn)行蛋白定量。取50μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，用5%牛血清白蛋白封閉1 h。加入1:1000一抗工作液（VEGF、AngⅠ），4℃孵育過夜；加入1：2000辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗，室溫下作用2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影，曝光。以相應(yīng)蛋白條帶的積分光密度值，除以GAPDH的值表示目的蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基在接種24 h、48 h和72 h，HUVECs增殖明顯增快，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對HUVECs增殖的影響

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在第24 h和48 h，條件培養(yǎng)基細(xì)胞劃痕寬度明顯小于對照組，提示條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)HUVECs遷移。見圖1。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)基對HUVECs遷移的影響

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) UVECs接種于Transwell小室培養(yǎng)12h發(fā)現(xiàn)，條件培養(yǎng)基組遷移至小室背面細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯增加。見表2。

表2 Transwell檢測不同培養(yǎng)基對HUVECs遷移的影響

2.4 免疫熒光染色 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的HUVECs表達(dá)VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達(dá)

2.5 Westernblot結(jié)果 Westernblot結(jié)果顯示，與普通培養(yǎng)基相比，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的HUVECs表達(dá)VEGF和AngⅠ明顯增高。見圖3。

圖3 Westernblot檢測不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下HUVECs的VEGF、AngⅠ表達(dá)情況

3 討 論

近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞在組織修復(fù)與再生中的作用日益受到重視。與其他干細(xì)胞相比，脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源豐富、容易獲取等優(yōu)點(diǎn)，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。研究[6]表明，ADSCs具有多項(xiàng)分化潛能，可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，直接參與血管的再生，并有望用于缺血性疾病的治療。最近研究[2,4]顯示，干細(xì)胞真正在體內(nèi)的轉(zhuǎn)分化作用是微乎其微的，無論自體或者異體局部注射干細(xì)胞大多數(shù)都以排斥清除的方式結(jié)束，干細(xì)胞的修復(fù)作用更多的是通過旁分泌及促進(jìn)靶細(xì)胞的自分泌實(shí)現(xiàn)的。ADSCs可以通過旁分泌TNF-α，IFN-γ，TGF-β，VEGF等，促進(jìn)新生血管的形成[7]。Lee EY等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)條件下，ADSCs能夠分泌低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α），與常氧條件下培養(yǎng)的ADSCs相比，誘導(dǎo)血管發(fā)生能力更強(qiáng)。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs中分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、VEGF、血管緊張素等，均促進(jìn)新生血管的發(fā)生。除此之外，ADSCs還能分泌一些免疫抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、酶以及小分子核糖核酸mi?croRNA（miRNA）等[10]，這些成分不但可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和生存，還可以減少炎癥反應(yīng)，提高修復(fù)速度和愈合質(zhì)量[11]。近年研究[12,13]發(fā)現(xiàn)，ADSCs能夠分泌生物活性成分中含有一種50 nm-150 nm的顆粒，稱為外泌體（Exo），ADSCs-Exo外泌體中包含蛋白、脂質(zhì)體、mRNA，miRNA等，而miRNA可能發(fā)揮了軸心作用，可以通過對靶細(xì)胞的調(diào)控發(fā)揮作用。外泌體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物安全性高、移植后無免疫排斥，是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的新興熱點(diǎn)[14]。

血管的形成需要內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，以及內(nèi)皮細(xì)胞、血管生成因子等與周圍蛋白之間的相互作用。在趨化作用下，內(nèi)皮細(xì)胞穿透血管基底膜，侵入細(xì)胞外基質(zhì)并形成管狀結(jié)構(gòu)，繼續(xù)延伸，分支并形成網(wǎng)絡(luò)。VEGF/VEGF-R通路在這一過程中發(fā)揮重要作用，可以誘導(dǎo)相關(guān)基金表達(dá)，調(diào)控血管滲透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，抑制細(xì)胞凋亡[15]。我們通過提取ADSCs培養(yǎng)上清與HUVECs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的HUVECs增殖和遷移，并表達(dá)VEGF，AngⅠ等，初步闡明ADSCs可以通過旁分泌促進(jìn)新生血管的發(fā)生。而由于ADSCs培養(yǎng)上清不含細(xì)胞成分，免疫原性低，無潛在致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，克服了細(xì)胞治療臨床應(yīng)用的局限性，且易于攜帶、轉(zhuǎn)運(yùn)和保存，有望替代干細(xì)胞移植，形成臨床標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。