鐵死亡的發(fā)生機制及在肝臟疾病中的作用

張飛宇，阿迪拉·亞克普，趙金明，高沿航

吉林大學第一醫(yī)院 肝病科，長春 130021

細胞死亡是生命活動過程中一項重要的生理或病理現象。鐵死亡(ferroptosis)是新近發(fā)現的一種程序性死亡方式，在形態(tài)、生物化學、遺傳學水平上，與其他類型的死亡方式如凋亡、壞死、自噬等明顯不同[1]。鐵死亡在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，如帕金森病、缺血再灌注損傷、腫瘤等。近期研究[2-5]顯示，在多種肝臟疾病中均發(fā)現不同程度的鐵代謝紊亂和脂質過氧化物集聚等鐵死亡特征，而調控鐵死亡可以影響肝臟疾病進程。本文旨在總結和評價鐵死亡的發(fā)生機制及在肝臟疾病中的作用與進展，為未來肝臟疾病診療水平的提升提供新思路。

1 概述

1.1 鐵死亡概念的提出及特征 使用高通量篩選技術發(fā)現了最早的鐵死亡誘導劑，erastin和ras選擇性致死化合物(ras-selective-lethal compound, RSL3)。研究發(fā)現，凋亡、壞死和自噬抑制劑均不能抑制二者誘導的細胞死亡，相反，抗氧化劑和鐵螯合劑可以抑制這一過程。隨后證實這種細胞死亡方式與細胞內鐵和自由基(reactive oxygen species, ROS)有關[6-7]。2012年，Dixon等[1]將這種鐵依賴性、脂質過氧化物集聚為特征的死亡方式命名為鐵死亡。線粒體的變化是鐵死亡的主要形態(tài)學特點，包括線粒體體積變小、膜密度增加以及線粒體減少或消失。在生化特征上，鐵死亡表現為谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗竭、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GXP4)失活，脂質過氧化物集聚等。

1.2 鐵死亡發(fā)生機制

與目前已知的四種細胞死亡方式不同(圖1)，鐵死亡發(fā)生機制主要與鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統(tǒng)失衡和脂質過氧化物集聚有關(圖2)。當鐵代謝紊亂引起細胞內游離鐵增多時，鐵通過芬頓反應催化產生ROS，ROS進一步促進脂質過氧化，引起脂質過氧化物集聚，誘發(fā)鐵死亡。位于細胞膜的胱氨酸/谷氨酸逆轉運體(cystine/glutamate antiporter system, system XC-)參與GSH的合成，GPX4利用GSH為底物將脂質過氧化物還原為正常的脂質，防止脂質過氧化物集聚，抑制鐵死亡發(fā)生[8]。因此，鐵死亡是由GPX4清除過氧化物能力不足和/或脂質過氧化反應過強造成脂質過氧化物集聚，最終誘發(fā)細胞死亡。

注：a,肝細胞的外源性凋亡機制;b,壞死性凋亡機制;c,焦亡機制;d,自噬機制。

圖2 鐵死亡發(fā)生機制圖

1.2.1 氨基酸抗氧化系統(tǒng)失衡 氨基酸在鐵死亡中扮演了重要角色。生理條件下，system XC-由溶質轉運家族7A11(solute carrier 7A11, SLC7A11)和SLC3A2組成，將胱氨酸運輸至細胞內并被還原為半胱氨酸，用于合成細胞內主要的抗氧化劑GSH。GSH是GPX4的一個必要輔因子，可將還原型GSH轉化為氧化型GSH，同時還原脂質過氧化物，從而減輕氧化應激損傷[8]。Erastin、p53、索拉非尼通過抑制system XC-和/或GSH合成間接抑制GPX4活性[9-10]，而RSL3能直接抑制GPX4活性[8]，無論是間接或直接抑制GPX4，均會導致清除脂質過氧化物能力不足，細胞內脂質過氧化物集聚，誘發(fā)鐵死亡。因而，system XC-和GPX4是鐵死亡氨基酸代謝中的重要調控靶點。

1.2.2 鐵代謝紊亂 血液循環(huán)中的Fe3+與轉鐵蛋白結合并運輸，通過轉鐵蛋白受體1進入細胞后被還原并釋放到胞質的不穩(wěn)定鐵池(labile iron pool, LIP)中，而多余的鐵貯存在鐵蛋白中。胞內LIP，主要以Fe2+的形式存在，由于Fe2+的不穩(wěn)定性和高反應活性，鐵通過芬頓反應產生羥自由基，可直接與細胞膜、質膜中的多不飽和脂肪酸反應，產生大量脂質ROS，導致細胞死亡。核受體輔助激活因子4作為貨物受體將鐵蛋白靶向運至溶酶體并進行自噬性降解，進而釋放游離鐵，該過程被稱為鐵自噬，主要負責鐵的釋放和回收[11]。研究[6,12]顯示，增加鐵蛋白降解或抑制鐵蛋白表達，會增加胞內LIP，提高細胞對鐵死亡的敏感性，相反，鐵抑素及其衍生物、鐵螯合劑通過減少細胞內鐵離子含量或抑制多種催化脂質過氧化反應的含鐵金屬酶活性增加鐵死亡抗性[13]。此外，核因子E2相關因子 2 (nuclear factor E2-related factor 2, NRF2)、熱休克蛋白 B1等基因通過抑制轉鐵蛋白受體1表達，影響鐵代謝進而調節(jié)細胞對鐵死亡的敏感性[14-15]?？傊?，鐵吸收增加或鐵儲存減少均會影響細胞對鐵死亡的敏感性。

1.2.3 脂質過氧化物集聚 脂質過氧化物集聚是鐵死亡的核心，脂質代謝組學顯示鐵死亡過程中多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(arachidonoyl, AA)或腎上腺酸(adrenoyl, AdA)是最容易發(fā)生氧化反應的脂質，且受三種合成酶調控。乙酰輔酶A合成酶長鏈家族4(acyl-CoA synthetase long-chain family 4, ACSL4)將AA或AdA催化為花生四烯酰-輔酶A和腎上腺酰-輔酶A，然后溶血卵磷脂酰基轉移酶3 (lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)將其酯化為磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines, PEs)形成AA-PE和AdA-PE，最后經脂肪氧合酶氧化為脂質過氧化物。研究[16-18]顯示，敲除或抑制上述三種合成酶均可抑制鐵死亡的發(fā)生發(fā)展。脂質過氧化物分解代謝生成毒性的醛類物質如4-羥基-2-壬烯醛或丙二醛，聯(lián)合細胞膜、質膜上持續(xù)的氧化反應，最終造成細胞膜、質膜結構和功能不可逆破壞，導致細胞死亡[12]。

2 鐵死亡與肝臟疾病的關系

肝損傷的類型取決于損傷的性質及嚴重程度，盡管不同性質的肝臟疾病可以由不同原因引起，但是肝臟病變由肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至原發(fā)性肝癌演變的病理機制是相似的。研究顯示，在肝臟疾病的不同發(fā)展階段中，均發(fā)現鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統(tǒng)失衡和脂質過氧化物集聚等鐵死亡特征，而調控鐵死亡可以影響肝臟疾病進程。因此，探究鐵死亡在肝臟疾病中的作用，有助于為治療肝臟疾病提供新策略。

2.1 鐵死亡在肝臟炎癥及纖維化中的作用 遺傳性血色素沉著病(hereditary hemochromatosis, HH)是遺傳性系統(tǒng)性鐵過載，鐵沉積在各個器官中，通過芬頓反應產生ROS，引起氧化損傷，最終導致嚴重的慢性并發(fā)癥，包括肝硬化、糖尿病和心臟病。 HH病理特點表現為鐵調素-鐵轉運蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，由此導致鐵過載。臨床前研究[19]顯示，HH小鼠模型肝內鐵過載可以誘發(fā)肝細胞和巨噬細胞鐵死亡。

酒精性肝病(alcohol related liver disease, ALD)是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病。研究[20]顯示，ALD患者血清鐵調素降低，而二價金屬離子轉運體在腸道中表達增加，導致血清中鐵及鐵蛋白水平增加 。乙醇會破壞沉默調節(jié)蛋白1(sirtuin type 1，SIRT1)的活性，Yin等[21]在比較乙醇喂養(yǎng)的敲除SIRT1小鼠與野生型小鼠研究中發(fā)現，敲除SIRT1會加重脂質代謝異常，促進肝臟脂質過氧化。這些特點提示ALD患者存在鐵死亡的關鍵特征。然而，最近有研究[2]認為，腸道SIRT1失活能改善乙醇誘導的肝臟鐵穩(wěn)態(tài)失調，進而改善酒精性肝損傷，其認為，腸道SIRT1失活的這種肝臟保護作用與抑制鐵死亡有一定關系。這與Yin等的發(fā)現相左，有關ALD腸道SIRT1與鐵死亡的關系仍需進一步研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是單純性脂肪肝進展至肝硬化的中間階段，目前尚不清楚單純性脂肪肝向脂肪性肝炎轉變的潛在機制。2020年初，由22個國家30位專家組成的國際專家小組發(fā)布的有關代謝相關脂肪性肝病 (metabolic associated fatty liver disease, MAFLD) 新定義的國際專家共識[22]，建議用“MAFLD” 取代“NAFLD”。基于既往大量文獻中使用NAFLD，在本文中仍然沿用此稱謂。在NASH的發(fā)病機制中，脂質過氧化物集聚引起的氧化應激被認為是重要的起始因子，而代謝紊亂所致的鐵沉積也被認為是NASH加重因素。因此，在NASH發(fā)病機制中可能存在鐵死亡。Tsurusaki等[23]研究發(fā)現，在缺乏膽堿富含乙硫氨酸飲食小鼠模型中，應用鐵死亡抑制劑可以抑制ALT、AST等肝損傷標志物和TNFα、IL-6等炎癥細胞因子升高，其認為鐵死亡是導致單純性脂肪肝發(fā)展為NASH的誘因 。隨后，Li等[3]在蛋氨酸膽堿缺乏飲食小鼠模型中發(fā)現，鐵死亡特征表現包括ROS集聚、線粒體形態(tài)改變和鐵死亡相關基因上調等，抑制鐵死亡能減輕小鼠肝損傷、炎癥反應甚至纖維化程度。

肝纖維化是肝硬化的早期可逆階段，是各種病因引起慢性肝損傷后的疤痕修復反應。其發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞(HSC)激活后導致的細胞外基質大量積累。靶向活化的HSC死亡是治療肝纖維化的重要目標之一。Zhang等[24]研究發(fā)現，索拉非尼和erastin能靶向誘導HSC鐵死亡，且這一過程與RNA結合蛋白胚胎致死性異常視覺基因1水平升高有關，進一步研究發(fā)現，其能穩(wěn)定自噬相關蛋白Beclin-1的表達，促進整體自噬水平，誘導核受體輔助激活因子4與鐵蛋白重鏈結合，降解鐵蛋白，增加LIP，誘導HSC鐵死亡。血紅素加氧酶1(hemeoxygenase-1, HO-1)是細胞鐵死亡的關鍵調控因子。異甘草酸鎂可上調HO-1表達，進而促進轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、鐵蛋白重鏈過表達，鐵外排泵—膜鐵轉運蛋白低表達，導致細胞內鐵沉積，脂質過氧化物集聚，誘發(fā)HSC鐵死亡，抑制肝纖維化形成[25]。因此，靶向激活鐵自噬及HO-1誘導HSC鐵死亡或是治療肝纖維化的新途徑。

2.2 鐵死亡在肝癌及索拉非尼耐藥中的作用 肝細胞癌(HCC)是造成全球嚴重疾病負擔的惡性腫瘤之一 ，在最常見的癌癥中占第六位 ，在癌癥相關死亡中占第二位。Louandre等[5]在研究HCC索拉非尼作用機理時發(fā)現HCC與鐵死亡存在密切聯(lián)系。近年來，有許多關于HCC與鐵死亡的相關研究，已知的鐵死亡在肝癌中的調控途徑有：(1)鐵死亡主要受system XC-和GPX4調控，影響system XC-或GPX4活性能誘導肝癌細胞鐵死亡[26]。常見的鐵死亡誘導劑erastin及索拉非尼均能通過抑制system XC-誘導鐵死亡。Tang等[27]將索拉非尼裝載到錳硅納米顆粒中，通過雙重耗竭GSH，誘發(fā)鐵死亡。(2)p53是腫瘤抑制基因，通過調控鐵死亡影響HCC發(fā)生發(fā)展。1)Jiang等[9]研究發(fā)現，p53下調SLC7A11轉錄，影響system XC-活性，進而誘導肝癌細胞鐵死亡。2)p53上調精胺/精脒-N1-乙?；D移酶1表達，使花生四烯酸15脂氧合酶水平升高，促進脂質過氧化物集聚，誘發(fā)鐵死亡[28]。3)Gao等[29]發(fā)現鐵死亡的發(fā)生需要谷氨酰胺和谷氨酰胺酶2。谷氨酰胺酶2是谷氨酰胺轉化為谷氨酸的關鍵酶，調節(jié)GSH合成。p53上調谷氨酰胺酶2轉錄，其過表達抑制腫瘤細胞生長和集落形成。(3)其他的調控途徑：CDGSH鐵硫結構域1，一種線粒體鐵輸出蛋白，靶向抑制CDGSH鐵硫結構域1，可以促進線粒體鐵沉積和ROS生成，誘發(fā)鐵死亡[30]；miRNA-214通過抑制激動轉錄因子4表達，抑制GSH合成，誘導肝癌細胞鐵死亡[31]；抑癌基因BRCA1相關蛋白1通過抑制SLC7A11表達，誘發(fā)鐵死亡[32]?？傊?，這些鐵死亡在HCC中的分子機制均提示鐵死亡在HCC的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

索拉非尼，一種多激酶抑制劑，是首個獲批用于晚期HCC患者的全身療法。研究[5]顯示，相較于索拉非尼激酶抑制活性的促凋亡效應，其通過抑制system XC-誘發(fā)肝癌細胞鐵死亡效應更加顯著 。有研究報道，索拉非尼或許是通過調節(jié)肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4A)和腫瘤高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1, HIC1)轉錄調控進而促進肝癌細胞鐵死亡。Zhang等[33]發(fā)現了兩類基因：鐵死亡上調因子和鐵死亡下調因子，其產物通過影響GSH合成而在調節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮相反作用。鐵死亡上調因子由HIC1調控，而鐵死亡下調因子由HNF4A調控。他們發(fā)現與正常肝組織相比，肝癌中 HNF4A上調，而HIC1下調，證實鐵死亡在肝癌中受到抑制，erastin能破壞HNF4A和HIC1之間的平衡從而誘導肝癌細胞鐵死亡，由于erastin與索拉非尼有相似的促進鐵死亡作用，他們認為或許索拉非尼也通過此途徑誘導鐵死亡。這有待進一步研究證實。

盡管索拉非尼已被廣泛用于臨床，但治療效果短暫，幾乎所有患者在應用索拉非尼的幾個月內就出現耐藥性。研究發(fā)現，索拉非尼耐藥與鐵死亡密切相關：(1)索拉非尼激活p62-Keap1-NRF2途徑增加肝癌細胞鐵死亡抗性[14]。(2)Sun等[34]發(fā)現索拉非尼激活NRF2后，上調金屬硫蛋白-1G，金屬硫蛋白-1G通過阻斷GSH耗竭介導的肝癌細胞脂質過氧化而發(fā)揮負性調節(jié)作用。(3)Bai等[35]首次證明在索拉非尼作用下的肝癌細胞，由于NRF2失活和隨后ROS集聚，sigma 受體表達被動上調并通過減少GSH消耗拮抗鐵死亡；另一方面，該研究團隊應用氟哌啶醇，一種sigma 受體拮抗劑，確證其可以協(xié)同索拉非尼促進肝癌細胞鐵死亡[36]。(4)在研究索拉非尼對蛋白質內穩(wěn)態(tài)影響的實驗中發(fā)現，索拉非尼抑制蛋白質生物合成，Sauzay等[37]認為這種抑制作用或許是肝癌細胞暴露于索拉非尼后產生的適應性應激反應，其保護肝癌細胞拮抗鐵死亡。(5)視網膜母細胞瘤(retinoblastoma, Rb)蛋白是調節(jié)真核細胞多種基因轉錄功能的蛋白家族成員之一, 它主要作為細胞增殖、細胞周期進程的負性調節(jié)因子。Rb的功能喪失在HCC中很常見。研究[38]報道，Rb蛋白缺乏的肝癌細胞在暴露于索拉非尼時細胞死亡率比Rb蛋白水平正常的肝癌細胞高2～3倍，或許評估肝癌患者的Rb狀態(tài)可用于判斷肝癌患者應用索拉非尼的耐藥性。以上鐵死亡參與的肝癌索拉非尼耐藥機制可能為解決索拉非尼耐藥提供新思路。

2.3 鐵死亡在其他肝病中的作用 藥物性肝損傷(DILI)是指由藥物本身或其代謝產物等引起的肝損傷。對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)是常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，過量服用APAP是誘發(fā)DILI最主要的原因之一。其特征為GSH耗竭，GPX受抑制和不依賴于凋亡相關的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 ，這與鐵死亡的特征高度契合。L?rincz等[4]對比鐵死亡抑制劑、壞死性凋亡抑制劑和抗氧化劑在不同APAP濃度下肝細胞活力，發(fā)現給予小鼠高濃度的APAP(10 mmol/L)時，鐵死亡抑制劑Fer-1有明顯的抑制肝細胞損傷作用，而更高濃度(20 mmol/L)時，這種保護作用更加顯著。自身免疫性肝病患者血清中鐵調素水平低于正常人，提示可能出現肝內鐵過載，在刀豆蛋白A誘發(fā)的小鼠急性肝損傷模型中，小窩蛋白1通過抑制活性氮集聚增加肝細胞鐵死亡抗性[39]。阻斷肝期瘧原蟲感染的肝細胞SLC7A11-GPX4通路使脂質過氧化物集聚，誘導鐵死亡發(fā)生，可以清除肝期瘧疾感染[40]。

3 展望

鐵死亡是一個復雜的細胞死亡過程，其發(fā)生機制涉及多種調控因素。近年來的研究進展為鐵死亡的分子機制提供了新的認識，特別是鐵死亡與細胞代謝的關系，但仍存在許多關鍵問題尚待解決，例如，最終誘發(fā)鐵死亡的分子是什么？脂質過氧化物集聚是如何引發(fā)鐵死亡的？調控鐵死亡的主要代謝過程如鐵、氨基酸、脂質代謝是如何相互聯(lián)系，最終決定細胞是生存還是鐵死亡？此外，鐵死亡與多種人類疾病尤其是肝臟疾病的相關性也已得到很好的證實，鐵死亡的提出為解決各類肝臟疾病尤其是HCC、HCC索拉菲尼耐藥等問題提供了新的研究方向和思路，但是鐵死亡在多大程度上影響肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展仍不清楚，而鐵死亡在各類肝臟疾病中的作用也不盡相同，需要更加深入地了解鐵死亡的分子機制及在肝臟疾病中的作用，為各類肝臟疾病提供新的治療策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張飛宇負責選題，收集分析資料，撰寫文章；阿迪拉·亞克普、趙金明參與選題，收集資料；高沿航教授擬定寫作思路，指導撰寫文章，提供修改意見并最終定稿。