陳曉雨 張建 張新亞 唐雨婷 邵鈺晨 羅志丹 盧辰

（1.江蘇海洋大學江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），連云港 222005）

Tth DNA聚合酶是一種從嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）分離得到的耐熱DNA聚合酶［1］。與同樣來源于棲熱菌屬的Taq DNA聚合酶不同，在僅有Mg2+存在時，Tth DNA聚合酶表現出一般的DNA聚合酶活性；但還有Mn2+存在條件下，該酶同時具有耐高溫逆轉錄酶活性和DNA聚合酶的活性［2］。因此自1990年發(fā)現Tth DNA聚合酶后，研究者很快將其嘗試用于丙型肝炎、流感病毒等RNA病毒的逆轉錄-熒光定量PCR檢測［3-5］。更重要的是，Tth DNA聚合酶對于血液、肌肉等生物組織中含有的PCR抑制成分具有較強的耐受性［6-7］，十分適合用于粗樣本快速檢測［8］。然而，野生型Tth DNA聚合酶存在比活力低［9-10］、熱穩(wěn)定性不如Taq DNA聚合酶［11］、Mn2+影響PCR擴增保真性［12］等缺陷，阻礙了其廣泛應用。

近年來，隨著蛋白質工程技術的發(fā)展，研究者開始重新審視Tth DNA聚合酶的改造和應用［13-15］。在此過程中，如何快速準確測定Tth DNA聚合酶的活性，是準確評估蛋白質改造和生產工藝優(yōu)化效果的前提。目前測定DNA聚合酶活力的方法主要有：（1）同位素標記法，利用同位素3H標記的dNTP，把30分鐘內在最適反應溫度下將10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量定義為1個活力單位（U），該方法最為準確，也是國內外主流廠商約定俗成的DNA聚合酶活力定義標準。但受限于同位素操作資質與放射性防護條件，很難在普通實驗室實現。（2）瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量PCR法，使用已標定酶活的對照品與樣品擴增同樣的模板，通過比較產物凝膠電泳條帶亮度或熒光定量PCR的Ct值來計算樣品活性相對于對照品的倍數。這兩種方法只能實現相對定量，耗時長，且受對照品批次間活力標定不穩(wěn)定因素影響較大，重復性差，靈敏度低。（3）熒光染料法。2018年國家標準化管理委員會發(fā)布了《Taq DNA聚合酶》的推薦性國家標準［16］，其中酶活檢測采用了與同位素法類似的等溫聚合反應，但最后使用雙鏈特異性的熒光染料PicoGreen來定量測定新生成的雙鏈DNA，避免了使用同位素。然而，該方法在74℃下直接測定雙鏈產物的熒光值，忽略了此溫度下產物中的雙鏈大多數呈解鏈狀態(tài)，使用雙鏈特異性染料測得的熒光值根本無法反映真實的產物量，導致該標準并未被廣泛采納。此外，還有其他一些利用熒光標記探針的方法［17-19］，但探針設計復雜，熒光標記價格昂貴，且標記基團可能會影響聚合酶活性，也未能得到廣泛應用。

本研究對國標所采用的熒光染料法進行了大幅改進，重新設計了標準曲線繪制和DNA雙鏈產物量測定方式，期望建立一種準確度更高、重復性更好的Tth DNA聚合酶活性測定方法，并可以推廣到其他DNA聚合酶，助推生物工具酶的研發(fā)與改造。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 rTth DNA聚合酶（5 U/μL）：東洋紡（上海）生物科技有限公司；PicoGreen染料：蘇州宇恒生物科技有限公司；dNTP混合液（2.5 mmol/L each）：江蘇愚公生命科技有限公司；SYBR Green I染料：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。TE緩沖液（pH 8.9）配方：10 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA，pH 8.9（25℃）。野生型Tth蛋白與I640F突變體蛋白：本課題組自行重組表達。

1.1.2 儀器設備 Qubit 4熒光計：Thermo Fisher Scientific公司；Synteny Neo2多功能酶標儀：美國BioTek公司；LightCycler480 II熒光定量PCR儀：瑞士羅氏集團；恒溫金屬浴：杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探針設計與合成 起始探針H1為一段寡聚脫氧核苷酸，包括16 bp的配對區(qū)和5′端25 nt的單鏈區(qū)。該探針可自行形成莖環(huán)結構，其3′配對區(qū)作為引物，以5′端未配對的25 nt單鏈區(qū)為模板，加入DNA聚合酶和dNTP后即可進行DNA聚合反應，從而形成完整的41 bp配對，產物命名為H2（圖1）。委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成H1和H2樣品。

圖1 發(fā)夾型探針示意圖Fig.1 Hairpin probe

1.2.2 H2含量與熒光增加值的線性關系 使用Qubit 4 熒光計精確測定所合成的H1和H2兩種探針的雙鏈配對區(qū)域濃度（ng/μL），根據H1和H2的配對區(qū)核苷酸序列，使用在線工具（http：//www.endmemo.com/）換算成摩爾濃度。然后用TE緩沖液（調整到 Tth聚合酶最適pH 8.9）將H1和H2均稀釋為 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L 和 0.8 μmol/L 三組。每組相同摩爾濃度的H1和H2溶液，再與PicoGreen染料和TE緩沖液按表1所示不同比例混合，配制成100 μL（此體積為酶標儀可準確檢測的最小體積）的探針工作溶液，每種比例設置3個重復。

將上述6種工作溶液放入多功能酶標儀中，在30℃下，以480 nm波長激發(fā)，520 nm發(fā)射測定熒光值。將每個比例工作溶液測得的熒光值，減去僅含H1探針工作溶液的熒光值，得到含有不同濃度H2探針工作溶液的熒光增加值。然后以100 μL工作溶液中H2探針含量（單位pmol）為橫坐標，熒光增加值為縱坐標，使用GraphPad Prism軟件進行線性回歸，驗證H2探針含量與熒光增加值之間的線性關系及線性范圍。取線性關系較好的一組為標準曲線，建立回歸方程，并以該濃度H1溶液作為后續(xù)酶活測定的底物溶液。

表1 標準曲線探針工作溶液配方Table 1 Probe working solution formulations for standard curve

1.2.3 酶活測定及飽和度實驗 將商業(yè)化rTth DNA聚合酶原液稀釋500、1 000、2 000、4 000和8 000倍，分別配制表2的酶活測定反應體系，每組設置3個重復。同時配制不加酶液的陰性對照。

表2 Tth DNA聚合酶活性檢測反應體系Table 2 Reaction system for Tth DNA polymerase activity assay

國際上通行的Tth聚合酶1個活力單位（U）定義為30 min內在74℃下將10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量。因此將配好的反應溶液在74℃下分別孵育5 min、15 min和30 min后，加入1 μL 0.5 mol/L EDTA溶液終止反應。然后緩慢冷卻到室溫使產物退火復性為雙鏈，加入0.5 μL PicoGreen染料，再用TE緩沖液（pH 8.9）稀釋到100 μL，放入酶標儀在30℃下測定熒光值。用反應后溶液相對不加酶液陰性對照的熒光增加值，與反應時間作圖。如果某個稀釋倍數下，熒光增加值與反應時間呈線性關系，則可將反應30 min后的熒光增加值代入標準曲線方程中，計算出100 μL反應體系中產物H2的含量（pmol），按下式計算得到原酶液活力：

原酶液活力（U/μL）=（30 min產物量（pmol）×25 × 稀釋倍數）/ 10000

熒光增加值與反應時間呈線性關系的稀釋倍數區(qū)間所對應的稀釋液酶活，即為本方法的定量范圍。

1.2.4 熒光定量PCR驗證 取本實驗自行重組表達獲得的Tth DNA聚合酶野生型蛋白（1.57 mg/mL，純度＞90%）和I640F突變體蛋白（1.48 mg/mL，純度＞90%），均稀釋200、500和1 000倍后，采用上述方法測定原液酶活。然后使用商業(yè)化rTth、重組表達野生型Tth和I640F突變體3種原酶液，以同樣濃度的pUC18質粒為模板，使用相同引物（引物序列為 F：5′-AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTC-3′，R ：5′-GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCA-3′），采用SYBR Green I染料法按相同程序進行熒光定量PCR。將3種酶液對應的Ct值差值換算為產物量相對倍數，與本方法測得的活力進行對比。

2 結果

2.1 核酸產物與熒光增加值的線性關系

根據PicoGreen熒光染料說明書，該染料對雙鏈核酸的結合力是單鏈的1 000倍以上，且當雙鏈核酸濃度在1 ng/μL以下時，受激產生的熒光值與堿基對數量成正比。本研究首先使用總摩爾數相同但比例不同的H1與H2混合，模擬H1不斷反應生成H2的過程，該混合液相對僅含H1溶液的熒光增加值，理論上應當與H2相對H1增加的25 bp配對區(qū)（圖1）的摩爾濃度之間存在良好的線性，但線性范圍需要摸索。實驗結果表明，當實際配制的H1、H2母液濃度為0.43 μmol/L，對應100 μL工作液中H2探針雙鏈部分最高濃度為1.15 ng /μL時，H2含量與熒光增加值之間存在良好的線性關系，決定系數R2達到0.99以上，且3次重復測定間的偏差較小（圖2）。而探針母液濃度達到0.6 μmol/L以上（對應工作液中H2探針雙鏈部分最高濃度為1.5 ng /μL以上）時，線性關系較差。

圖2 熒光增加值與H2含量的標準曲線Fig.2 Standard curve of fluorescence intensity added and H2 content

2.2 Tth DNA聚合酶活性測定及定量范圍

將原酶液稀釋500倍和1 000倍后，反應5 min、15 min和30 min時的熒光增加值之間已明顯不呈線性關系，不能用于測定酶活；而稀釋2 000倍和4 000倍后，不同反應時間熒光增加值之間線性關系良好（圖3），因此可以選擇這兩個稀釋倍數來計算酶液活力。

圖3 不同稀釋倍數的rTth聚合酶在不同反應時間下的熒光增加值Fig.3 Fluorescence intensity added of rTth polymerase with different dilution ratios at different reaction times

由表3可知，稀釋2 000倍后測得的原酶液酶活為5.48 U/μL，稀釋4 000倍后測得的原酶液酶活為5.31 U/μL?？紤]到酶液生產廠商在分裝時一般會在標定值基礎上給予10%-20%左右的冗余，可以認為本方法測定的結果與標定值相符。而當將原酶液進一步稀釋8 000倍后，熒光增加值與反應時間的關系變得紊亂。因此認為本方法可以定量的稀釋液酶活范圍是 1.33×10-3-2.74×10-3U/μL。

2.3 熒光定量PCR驗證酶活

將本課題組重組表達獲得的野生型Tth DNA聚合酶蛋白和I640F突變體蛋白均稀釋200、500和1 000倍，使用上述方法測定酶活。結果表明200倍稀釋后兩種蛋白的熒光增加值與反應時間呈線性關系（圖4-A，4-B），計算得到的原液酶活分別為0.27 U/μL 和 0.57 U/μL。

表3 商業(yè)化Tth DNA聚合酶活性測試結果Table 3 Results of commercial Tth DNA polymerase activity assay

然后使用商業(yè)化rTth、自主表達野生型Tth和I640F突變體三種原酶液對相同的pUC18質粒模板進行熒光定量PCR反應。結果表明，野生型Tth DNA聚合酶得到的Ct值，與商業(yè)化rTth的Ct值相差4.28個循環(huán)，而與I640F突變體相差0.99個循環(huán)（圖4-C，表4）。折算成產物量可知，使用相同模板進行PCR后，野生型Tth獲得的產物量是商業(yè)化rTth的1/19.4，是I640F突變體的1/2，與本方法測得的酶活比例相符，表明本方法測得的酶活可以反映真實使用環(huán)境下的Tth DNA聚合酶活性。

圖4 重組表達Tth野生型與突變體蛋白的酶活測定與熒光定量PCR驗證Fig.4 Activity assay and fluorescence quantitative PCR validation of recombinant WT Tth and its mutant polymerase

3 討論

本研究建立的酶活測定方法與現有方法相比體現出3個優(yōu)勢：（1）無需同位素即可實現對Tth DNA聚合酶活性的絕對定量。已有研究證明，PicoGreen染料與產物雙鏈DNA結合激發(fā)的熒光值，與3H同位素標記所測得的dNTP摻入量有很好的相關性［20］，本研究實驗結果也證明本方法測得結果與商業(yè)化標定酶活一致，完全可以取代同位素。（2）利用未進行聚合反應之前的發(fā)夾型底物H1和發(fā)生聚合反應之后生成的產物H2，以一定的比例混合來設置標準曲線，最大程度模擬了聚合反應開始后的H1不斷消耗生成H2的動態(tài)變化，使標準曲線更真實地反映了酶活測定反應體系中的實際情況。本研究所繪制的標準曲線相關系數達到0.99以上，重復實驗之間偏差小，表明本方法的標準曲線準確度和重復性都比較理想。（3）反應30 min后不在74℃下直接測定熒光值，而是終止反應后將溫度降至30℃，使高溫下大部分解鏈的雙鏈重新退火形成完整雙鏈，測得的熒光值才能真實反映雙鏈產物的含量。本方法不僅可以用于Tth DNA聚合酶的活力測定，也可以推廣到Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等不具備3′-5′外切酶活性的各類DNA聚合酶活性測定。

表4 測得酶活與熒光定量PCR Ct值對比Table 4 Comparison of measured enzyme activity and fluorescence quantitative PCR Ct values

由于PicoGreen染料的熒光值與雙鏈DNA配對數僅在一定范圍內體現出良好的線性（官方標稱線性范圍是 1 pg/μL - 1 ng/μL，本研究實測在 1.5 ng/μL以上線性較差），故而測試反應體系中H1底物濃度不可太高。而在酶活測定過程中，要求底物在反應到30 min時仍然是過量的，因此本方法初步驗證得到的定量限，即加入反應體系的酶濃度一般應在1.33× 10-3- 2.74 × 10-3U/μL之間。這一方面表明本方法靈敏度極高；另一方面對于未知樣品，則需要多次嘗試高倍數梯度稀釋才能獲得較理想的結果。未來將進一步優(yōu)化以擴展該方法的測量范圍。

4 結論

利用一種高靈敏度雙鏈特異性核酸染料PicoGreen和發(fā)夾型探針底物，建立了一種終點法測定Tth DNA聚合酶活性的方法。該方法不依賴同位素，可實現以Tth DNA聚合酶為代表的DNA聚合酶活性的精確測定。