李曉宗 胡燕 吳平 宋云端

（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201300）

現(xiàn)代醫(yī)療儀器及耗材在臨床檢驗(yàn)中大量使用，并對(duì)檢驗(yàn)質(zhì)量造成深刻影響。真空采血管是一種檢驗(yàn)科大量使用的耗材，血液采集和分離是臨床生化檢驗(yàn)中極為重要的一環(huán)，影響著檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［1］。1990～2017年，糖尿病在中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)的位次從第19位上升到第8位［2］，糖尿病患者的診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估依賴于葡萄糖濃度的準(zhǔn)確檢測(cè)，隨著檢測(cè)方法學(xué)進(jìn)步和試劑標(biāo)準(zhǔn)化，血糖檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度大大提高，這時(shí)由糖酵解造成的分析前誤差逐漸成為葡萄糖檢測(cè)誤差的主要原因［3］。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均采用《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦的含有糖酵解抑制劑氟化鈉的葡萄糖專用采血管采集、保存、轉(zhuǎn)運(yùn)血糖標(biāo)本，但越來(lái)越多的研究證實(shí)由于氟化鈉起效較慢，不能及時(shí)抑制標(biāo)本內(nèi)葡萄糖的糖酵解反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)值和真實(shí)值之間出現(xiàn)偏差［4］，因此美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)（American Diabetes Association，ADA）和美國(guó)臨床生物化學(xué)學(xué)會(huì)（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）在2011年發(fā)布的血糖標(biāo)本采集指南中推薦使用檸檬酸酸化管替代氟化鈉管。目前存在的問(wèn)題是檸檬酸酸化血糖管亟待標(biāo)準(zhǔn)化，也缺乏分析性能方面的可靠性驗(yàn)證，使用檸檬酸酸化管后現(xiàn)有血糖參考區(qū)間和診斷閾值也需要重新評(píng)估及驗(yàn)證［5，6］，酸化管的推廣還存在一定障礙。冰水法一直作為ADA和NACB推薦方法用于血糖體外保存的研究，其要求標(biāo)本采集后立即放入冰水中并在30min內(nèi)完成血漿和細(xì)胞的分離，但這一方案實(shí)用性較差。現(xiàn)對(duì)該方法進(jìn)行了適當(dāng)改良，并采用基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范來(lái)判斷其保存血糖的效果，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 真空采血管

廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技有限公司提供，肝素鋰采血管（Φ13×75，批號(hào)：176898），EDTAK2－氟化鈉采血管（Φ13×75，批號(hào)：178798）。

1.1.2 儀器與試劑

分析儀器為ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀。試劑由Siemens－Bayer公司生產(chǎn)，批號(hào)為439419，檢測(cè)方法為己糖激酶法，定標(biāo)品為試劑配套，批號(hào)135808B。室內(nèi)質(zhì)控品由Beckman公司提供，低、中、高值批號(hào)分別為M701051、M701052、M701053。標(biāo)本測(cè)定前，進(jìn)行質(zhì)控品的測(cè)定，質(zhì)控通過(guò)后再進(jìn)行樣本的測(cè)定，同時(shí)加測(cè)質(zhì)控品，兩次質(zhì)控結(jié)果均符合要求則樣本測(cè)定結(jié)果有效。

1.1.3 冰水混合物容器

由小型標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱進(jìn)行簡(jiǎn)易改裝而成，冰塊為實(shí)驗(yàn)室自行制備。放置一試管架于轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)，冰塊放置試管架周圍，加水使液面距試管架頂端2cm處。肝素鋰管使用前放于箱內(nèi)預(yù)冷不少于30min，標(biāo)本采集時(shí)由箱內(nèi)取用，標(biāo)本采集完畢并標(biāo)注編號(hào)信息后迅速放回箱內(nèi)保存。

1.2 方法

20名自愿者由門診患者中招募，其中男9名，女11名，年齡45±11.5歲（26～66歲），無(wú)貧血及已知重大器官疾病、腫瘤、血液、免疫性疾病，血常規(guī)檢查白細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積正常。自愿者取坐姿由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的護(hù)士同時(shí)采血，標(biāo)本采集遵照《樣本采集手冊(cè)標(biāo)本》規(guī)定程序。自愿者使用預(yù)冷肝素鋰采血管連續(xù)采血4份，每份3ml，采集后立即放于轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)的試管架上（肝素鋰管冰水組）；使用EDTAK2－氟化鈉管連續(xù)采血3份，每份采血為3ml，采集后放置試管架室溫（25℃）保存（EDTAK2－氟化鈉管室溫組）。每位自愿者標(biāo)本采集完成后即刻取1份肝素鋰管標(biāo)本立即離心分離血漿并上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)值作為基準(zhǔn)值。然后分別在30、60、120min后按照自愿者標(biāo)本編號(hào)在兩組中隨機(jī)取1份離心檢測(cè)。所有標(biāo)本離心均在中國(guó)湘儀公司KH120R低溫離心機(jī)進(jìn)行，溫度設(shè)定為4℃，2500×g離心15min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism 7.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。符合正態(tài)分布實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以WESTGARD網(wǎng)站最新公布的個(gè)體內(nèi)生物變異（CVi）與個(gè)體間生物變異（CVG）計(jì)算血漿葡萄糖實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的最低、適當(dāng)和最佳的質(zhì)量指標(biāo)，最低質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.75CVi＋0.375（CVi2＋CVG2）0.5＝8.32%；適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.5CVi＋0.25（CVi2＋CVG2）0.5＝5.90%；最佳質(zhì)量指標(biāo)：TEa＜1.65×0.25CVi＋0.125（CVi2＋CVG2）0.5＝2.64%，并以此標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果是否可以被臨床接受。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測(cè)結(jié)果及比較

肝素鋰管冰水組和EDTAK2－氟化鈉管室溫組標(biāo)本放置30、60、120min后離心檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以表示（見表1）；兩組各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)值均隨著時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)進(jìn)行性下降，放置相同時(shí)間EDTAK2－氟化鈉管室溫組較肝素鋰管冰水組

表1 標(biāo)本放置0、30、60、120min后血糖測(cè)定結(jié)果（，mmol／L）

注：與基準(zhǔn)值比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

下降更為明顯；肝素鋰管標(biāo)本在冰水中放置30、60min血糖檢測(cè)值和即刻檢測(cè)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P值分別為0.1670、0.0553，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肝素鋰管冰水組120min、EDTAK2－氟化鈉管室溫組30、60、120min血糖檢測(cè)值與基準(zhǔn)值比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 兩組檢測(cè)結(jié)果偏差與質(zhì)量指標(biāo)的比較

肝素鋰管冰水組30、60、120min檢測(cè)結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差分別為－0.25%、－0.64%、－2.54%。EDTAK2－氟化鈉管室溫組30、60、120min檢測(cè)結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差分別為－3.67%、－6.07%、－7.76%（見圖1）。以WESTGARD網(wǎng)站最新公布的個(gè)體內(nèi)生物變異（CVi）與個(gè)體間生物變異（CVG）計(jì)算出的血漿葡萄糖實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最低、適當(dāng)和最佳的質(zhì)量指標(biāo)衡量：（1）肝素鋰管冰水組30、60、120min檢測(cè)結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差均小于最佳質(zhì)量指標(biāo)；（2）EDTAK2－氟化鈉管室溫組30min檢測(cè)結(jié)果介于最佳和適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)之間；（3）EDTAK2－氟化鈉管室溫組60、120min檢測(cè)結(jié)果與基準(zhǔn)值平均偏差大于適當(dāng)質(zhì)量指標(biāo)。

圖1 標(biāo)本放置30、60、120min后離心血糖測(cè)定結(jié)果與基準(zhǔn)值偏差

3 討論

實(shí)驗(yàn)耗材是專業(yè)院?；蜥t(yī)療單位的檢驗(yàn)檢測(cè)部門、第三方的獨(dú)立檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)以及其他的實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)工作的常用物品。隨著醫(yī)療過(guò)程安全性與便捷性越來(lái)越受到重視，耗材逐漸在醫(yī)療技術(shù)的應(yīng)用過(guò)程中發(fā)揮出更大的作用，尤其是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目的完成，必須依賴很多實(shí)驗(yàn)室耗材才能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

血糖是糖尿病診斷和治療監(jiān)測(cè)最為重要的指標(biāo)，但由糖酵解造成的檢驗(yàn)前誤差始終困擾著臨床血糖檢測(cè)［7］。糖酵解是指葡萄糖在無(wú)氧或缺氧的條件下分解為乳酸的同時(shí)產(chǎn)生少量ATP的過(guò)程，反應(yīng)溫度和酶活性可以顯著影響包括糖酵解反應(yīng)在內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，因此抑制糖酵解反應(yīng)中參與酶的活性和降低溫度都可以抑制、降低糖酵解的反應(yīng)進(jìn)程。

氟化鈉作為添加劑在臨床廣泛使用，但因?yàn)榉c所作用的烯醇酶位于糖酵解過(guò)程中的最后階段且為非限速酶，導(dǎo)致其4h以后才能完全發(fā)揮作用［8］。在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中，一般都是在標(biāo)本采集后立即進(jìn)行了血漿的分離檢測(cè)，從而得出氟化鈉是保護(hù)血糖的良好添加劑的結(jié)論，但標(biāo)本離心分離前在室溫下留置的這個(gè)時(shí)間段往往被忽視。據(jù)張吟眉［9］等報(bào)道，離心前的草酸鈉－氟化鈉采血管中的葡萄糖濃度隨放置時(shí)間增加而降低，王路等［10］報(bào)道氟化鈉抗凝管離心前、后放置血糖測(cè)定值有差異，放置2h后平均相差0.667mmol／L；氟化鈉另外一個(gè)重要的缺點(diǎn)是它對(duì)紅細(xì)胞的完整性破壞較為嚴(yán)重［11］，因此在2011年ADA和NACB發(fā)布的血糖標(biāo)本采集指南中推薦在采血管中加入檸檬酸替代氟化鈉添加劑。檸檬酸緩沖液可以使反應(yīng)體系的pH值降低為5.5，抑制了糖酵解反應(yīng)初始階段的限速酶——己糖激酶，使糖酵解在初始階段即被終止，一些文獻(xiàn)也表明檸檬酸管對(duì)血糖的穩(wěn)定作用大大優(yōu)于氟化鈉管，溶血狀況也得到了改善［12，13］。但亦有文獻(xiàn)研究指出采用檸檬酸添加劑后現(xiàn)有的糖尿病診斷閾值、參考區(qū)間還需要大量臨床數(shù)據(jù)的重新評(píng)估及驗(yàn)證［14］，大規(guī)模臨床應(yīng)用尚存在障礙。溫度對(duì)酶活性有顯著影響，所以溫度也是決定酶催化化學(xué)反應(yīng)速率的關(guān)鍵因素，溫度降低酶促反應(yīng)減弱或停止，溫度升高反應(yīng)速度加快［15］。糖酵解反應(yīng)作為一種酶催化化學(xué)反應(yīng)，溫度降低可以顯著降低糖酵解反應(yīng)。血糖標(biāo)本放入冰水混合物后，由于冰水的物理降溫作用，使標(biāo)本溫度降低，糖酵解進(jìn)程減緩，標(biāo)本內(nèi)葡萄糖的“損耗”減少。有研究表明，血液進(jìn)入采血管后其溫度從體溫降至0℃需要10min左右［16］，因此該研究在標(biāo)本采集前即對(duì)采血管進(jìn)行了預(yù)冷卻處理，使標(biāo)本溫度降低得更為迅速，減少糖酵解作用對(duì)標(biāo)本內(nèi)血糖的損耗?；谏飳W(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范是處于1999年“建立全球檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分析質(zhì)量規(guī)范策略”會(huì)議協(xié)商決定的目前質(zhì)量規(guī)范五級(jí)層級(jí)模式中的第二級(jí)，它著重考慮了臨床檢驗(yàn)結(jié)果主要用于疾病監(jiān)測(cè)和診斷的醫(yī)學(xué)需求［17］，優(yōu)于目前大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室采用的處于質(zhì)量規(guī)范層級(jí)模式中第4級(jí)的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室修正法規(guī)（CLIA′88），所以選用了基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范來(lái)評(píng)價(jià)本次試驗(yàn)中血糖的偏差。實(shí)驗(yàn)表明，改良冰水法能夠在2h內(nèi)有效“保護(hù)”血糖，標(biāo)本檢測(cè)平均偏差小于基于生物學(xué)變異的最佳質(zhì)量指標(biāo)，能夠被臨床接受。該研究篩選自愿者時(shí)排除了白細(xì)胞升高、紅細(xì)胞壓積不在正常范圍者，對(duì)于此類患者的血糖標(biāo)本使用冰水法保存其效果是否理想還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究表明，真空采血管進(jìn)行了預(yù)冷處理后其對(duì)血糖標(biāo)本中血糖的保護(hù)作用明顯提升，在不增加耗材成本的基礎(chǔ)上提高了血糖檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)表明，氟化鈉添加劑采血管采集葡萄糖標(biāo)本后如不能及時(shí)離心檢測(cè)其結(jié)果用于臨床診斷及病情判斷并不可靠，容易造成不良醫(yī)學(xué)后果。改良冰水冷卻法可以在2h內(nèi)有效保存葡萄糖標(biāo)本，可以被臨床接受，進(jìn)一步完善后可用于離心前血糖標(biāo)本的保存。