冷凍儲(chǔ)藏下三唑類殺菌劑在香蕉中的殘留穩(wěn)定性研究

陳麗霞 陳歆 許麗建 彭黎旭

(1 瓊臺(tái)師范學(xué)院理學(xué)院 海南?？?571100;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 海南?？?571101)

三唑類殺菌劑近年來被廣泛用于防治香蕉葉斑病、黑心?。?-3］，但是由于三唑類殺菌劑具有藥效持續(xù)時(shí)間長、內(nèi)吸輸導(dǎo)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在香蕉中通常具有較長的降解半衰期，容易在香蕉果實(shí)中帶來殘留風(fēng)險(xiǎn)，是香蕉樣品中的最常見檢出農(nóng)藥之一［4-6］。在香蕉樣品的檢測(cè)過程中，樣品在采集制備后，通常不能立即檢測(cè)，需要冷凍儲(chǔ)藏一段時(shí)間后進(jìn)行分析。在此過程中，殘留的農(nóng)藥由于揮發(fā)或者發(fā)生一些水解、光解及酶促反應(yīng)等可能會(huì)發(fā)生降解，有可能發(fā)生降解代謝，引起濃度變化，影響測(cè)定結(jié)果。因此，想要準(zhǔn)確評(píng)估農(nóng)藥安全性，研究冷凍儲(chǔ)藏下農(nóng)藥殘留穩(wěn)定性具有重要的意義［7-9］。有研究報(bào)道多種農(nóng)藥的儲(chǔ)藏溫度、樣本基質(zhì)及基質(zhì)狀態(tài)對(duì)農(nóng)藥殘留的穩(wěn)定性均有影響，但不同的農(nóng)藥影響大小各不相同，其中溫度對(duì)農(nóng)藥的影響較為一致，冷凍條件下的農(nóng)藥殘留最穩(wěn)定［10-12］。

在我國GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，明確規(guī)定香蕉的測(cè)定部位為全蕉，但是由于香蕉果肉和果皮的成分并不相同，農(nóng)藥在冷凍儲(chǔ)藏過程中穩(wěn)定性可能存在差異［13-14］，對(duì)香蕉中農(nóng)藥殘留存在一定影響，但是目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究選擇丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑三種三唑類殺菌劑，研究其在香蕉全果、果肉和果皮中的穩(wěn)定性，為香蕉中三唑類殺菌劑的殘留檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

香蕉樣品采自海南省澄邁縣永發(fā)鎮(zhèn)香蕉種植基地。

1.1.2 儀器

實(shí)驗(yàn)儀器包括AB SCIEX API4000＋質(zhì)譜系統(tǒng)（AB SCIEX 公司），超高壓液相色譜系統(tǒng)（Waters公司），UPLC?BEH C18 色譜柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（沃特世科技（上海）有限公司）、高速離心機(jī)（IKA 公司）、多管渦旋混合機(jī)（北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司）、高速勻漿機(jī)（IKA 公司）、微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、精密移液槍、0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）。

1.1.3 試劑

實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（Millipore，USA），乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher 試劑公司），氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），PSA 吸附劑（N-丙基乙二胺，分析純，Biocomma 公司）。含丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑的農(nóng)藥制劑，分別購自?？谑修r(nóng)資店。丙環(huán)唑、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津），苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr Eh-renstorfer GmbH公司。

1.2 方法

1.2.1 冷凍樣品的制備

香蕉樣品采集后，將果肉和果皮分離，同時(shí)取香蕉全果，將香蕉全果、果肉和果皮切塊得到全果、果肉和果皮樣品。分別稱取500 g 香蕉全果、果肉和果皮樣品。準(zhǔn)確稱取10.0 g 香蕉全果、果肉和果皮塊狀樣品，裝入50 mL 離心管，分別添加0.1 和3.0 mg/kg 的丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑的農(nóng)藥制劑水溶液，作為冷凍香蕉樣品。在-20℃冷凍儲(chǔ)藏，在預(yù)定時(shí)間取出，制備成為勻漿樣品并進(jìn)行分析。

1.2.2 樣品前處理

在香蕉全果、果肉和果皮的空白樣品中分別加入丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3 種殺菌劑，并記為0 d。在香蕉冷凍儲(chǔ)藏后第15、30、60、90天，取樣品進(jìn)行分析，加入20 mL 乙腈，并高速勻漿2 min，加入氯化鈉2 g，蝸旋劇烈震蕩1 min后，以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min。取5 mL 上清液于PSA凈化劑中，蝸旋劇烈震蕩1 min，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心 5 min，取上清液 2.0 mL 經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，裝入進(jìn)樣小瓶，使用UPLC-MS/MS 進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 儀器分析條件

色 譜 條 件 ： ACQUITY UPLC?BEH C18 色 譜 柱（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.25 mL/min；所用流動(dòng)相為0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B）。梯度設(shè)置為：0～2 min：保持 95%A；2～4 min：A 從 95% 到 5%；4～5 min：保持5%A；5～7 min：A從5%到95%。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（ESI+）掃描，噴霧電壓：5 000 V；毛細(xì)管溫度：600℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。定性和定量的離子、去簇電位（DP）和碰撞電壓（CE）如表1所示。

表1 質(zhì)譜工作條件

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法準(zhǔn)確性及定量限

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，香蕉樣品存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。為了保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)均采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度10 μg/mL 的丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液，分別用全果、果肉和果皮空白樣品提取液逐級(jí)稀釋法配置0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，外標(biāo)法進(jìn)行定量。以丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑三種殺菌劑基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2 列出了3 種殺菌劑在甲醇溶液中線性方程及相關(guān)系數(shù)，其中丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑靈敏度較差，0.005 μg/mL 信號(hào)穩(wěn)定性較差，因此其線性范圍為0.01～0.5 μg/mL，戊唑醇的線性范圍為0.005～0.5 μg/mL?？紤]到液質(zhì)在測(cè)定目標(biāo)物存在基質(zhì)效應(yīng)，樣品測(cè)定時(shí)均采用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，其線性關(guān)系均優(yōu)于0.999。方法測(cè)定丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑的定量限分別為0.01、0.005和0.01 mg/kg。

表2 三種殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

本研究分別選擇定量限0.01 mg/kg 和最大的殘留限量3.0 mg/kg，并設(shè)置中間濃度0.10 mg/kg進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，分別在香蕉全果、果肉和果皮樣品中添加0.01、0.10 和3.0 mg/kg 三個(gè)不同濃度的3種殺菌劑，并通過回收率判定分析方法的準(zhǔn)確性。表3 列出了在0 d 時(shí)測(cè)定三種殺菌劑的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。我國標(biāo)準(zhǔn)“農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則（NY/T 788—2018）”中規(guī)定，添加水平在0.01、0.10 和3.0 mg/kg 時(shí)，回收率應(yīng)分別在60%～120%、70%～120%和70%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在30%、20%和10%以內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)在測(cè)試的3個(gè)濃度水平，丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足要求。

表3 三種殺菌劑在香蕉不同基質(zhì)中中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.2 香蕉不同基質(zhì)中3種殺菌劑的穩(wěn)定性

香蕉全果、果肉和果皮中，0.1 mg/kg 三種殺菌劑在冷凍儲(chǔ)藏下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑在香蕉不同基質(zhì)中120 d 內(nèi)均保持很好的穩(wěn)定性。在120 d 后，3種殺菌劑的穩(wěn)定性各不相同，其中丙環(huán)唑在360 d時(shí)，在香蕉全果、果肉和果皮中均能保持很好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在果皮中儲(chǔ)藏360 d 也能保持很好的穩(wěn)定性，但是在全果和果肉中儲(chǔ)藏180 和360 d 后，均存在一定的降解，其中果肉中殘留量最低，分別降低至83%和76%。說明3 種殺菌劑在香蕉果皮中最容易保持穩(wěn)定，其次為香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。

2.3 不同濃度的3種殺菌劑在香蕉中的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了0.1 和3.0 mg/kg 兩種不同濃度的丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑在香蕉不同基質(zhì)中的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，3 種殺菌劑在3.0 mg/kg 儲(chǔ)藏濃度時(shí)，丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3 種殺菌劑在儲(chǔ)藏360 d以后，其在全果、果肉和果皮3種樣品基質(zhì)中的濃度均能穩(wěn)定在90%以上。在0.1 mg/kg儲(chǔ)藏濃度時(shí)，丙環(huán)唑在全果、果肉和果皮3種樣品基質(zhì)中的濃度也能穩(wěn)定在90%以上；戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在香蕉果皮中濃度穩(wěn)定在95%以上，但是戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在全果和果肉中儲(chǔ)藏360 d 后，其濃度出現(xiàn)下降。說明丙環(huán)唑在實(shí)驗(yàn)的低濃度和高濃度時(shí)均能保持較好的穩(wěn)定性，戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在實(shí)驗(yàn)的高濃度時(shí)也保持較好的穩(wěn)定性，但是在低濃度時(shí)長時(shí)間儲(chǔ)藏可能會(huì)降解。

3 討論與結(jié)論

3.1 農(nóng)藥溶解度的影響

農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏中的降解受環(huán)境的溫度、濕度，農(nóng)藥本身的物理化學(xué)性質(zhì)，樣品基質(zhì)性質(zhì)包括樣品基質(zhì)的含水量、基質(zhì)的pH 值以及其所含的微生物、有機(jī)質(zhì)成分等影響［15］。有研究報(bào)道，農(nóng)藥的穩(wěn)定性與其水溶性相關(guān)［16］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在高濃度時(shí)均能穩(wěn)定儲(chǔ)藏360 d 以上，但是在低濃度時(shí)，戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑均存在一定的降解，其可能與3種殺菌劑的溶解度相關(guān)。

圖1 0.1 mg/kg三種殺菌劑在香蕉不同基質(zhì)中的穩(wěn)定性結(jié)果

3.2 樣品含水量的影響

樣品的含水量是影響農(nóng)藥穩(wěn)定性的另一重要因素［17］，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了香蕉全果、果肉和果皮3 種基質(zhì)的含水量，分別為70%～80%、60%～70%和85%～90%。結(jié)果表明，3 種殺菌劑的降解速率與含水量差異無顯著相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道生物代謝是影響苯醚甲環(huán)唑在芒果中降解的主要因素［18］，香蕉營養(yǎng)成分豐富，為生物代謝降解農(nóng)藥提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。香蕉果肉中的營養(yǎng)物質(zhì)明顯高于香蕉果皮［19-20］，可能導(dǎo)致丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑在果皮中穩(wěn)定性最好，在果肉中降解中速度較快。

圖2 不同濃度的3種殺菌劑在香蕉不同基質(zhì)中的穩(wěn)定性結(jié)果

3.3 樣品中農(nóng)藥殘留濃度的影響

我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定農(nóng)藥殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的添加水平至少應(yīng)達(dá)到各組分定量限的10 倍［21］，同時(shí)，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在香蕉中的最大殘留限量分別為1、3和1 mg/kg［22］。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.1 mg/kg 的低濃度，同時(shí)設(shè)置高濃度3 mg/kg。結(jié)果表明，3 種殺菌劑在低濃度和高濃度時(shí)冷凍儲(chǔ)藏均能保持較好的穩(wěn)定性，丙環(huán)唑在2種濃度是穩(wěn)定性差異不顯著，但是戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑在低濃度儲(chǔ)藏120 d 后下降速度加快，與高濃度差異顯著。這說明低濃度時(shí)殘留濃度容易受降解速率的影響，建議在樣品分析時(shí)應(yīng)盡快測(cè)定，避免濃度過低出現(xiàn)較大的變化。

本研究結(jié)果表明，丙環(huán)唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑3種殺菌劑在香蕉全果、果肉和果皮中有較好的冷凍儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。在儲(chǔ)藏360 d 以后，在全果、果肉和果皮3 種樣品基質(zhì)中的濃度均能穩(wěn)定在90%以上。而在3 種不同的香蕉基質(zhì)之間，3 殺菌劑在香蕉果皮中最容易保持穩(wěn)定，其次為香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。