黃 強，常金霞，鄭 碩，牛少輝，曹 乾，方毅娜，曹建春，張東萍

糖尿病足是糖尿病患者的嚴重并發(fā)癥之一，可伴有腎病、神經(jīng)病變、酮癥酸中毒和(或)心肌病[1]。糖尿病足年發(fā)病率在2%左右，在糖尿病患者中發(fā)病率為4.5%～10.0%，其中約66%的糖尿病足患者需要住院治療[2]。糖尿病足會直接導致患者生活能力下降，使生活質(zhì)量惡化，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大的經(jīng)濟負擔[3]。因此，開發(fā)促進糖尿病足創(chuàng)面快速愈合的治療藥物具有重要經(jīng)濟及社會價值。據(jù)報道顯示，糖尿病患者創(chuàng)面愈合緩慢，與炎性細胞浸潤并產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β等炎性細胞因子密切相關[4-5]。此外，持續(xù)高血糖抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)活性，從而降低血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)含量，導致糖尿病創(chuàng)面愈合延遲[6]。因此，抑制炎癥反應，促進創(chuàng)面血管生成將是治療糖尿病足的方向之一。當歸補血湯的主要功效為補氣生血，對產(chǎn)后血脫、勞傷血虛及瘡瘍潰后膿血過多等疾病具有良好的治療效果[7-8]。因此，本研究應用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病足大鼠模型，探究當歸補血湯能否通過抑制炎癥反應和促進血管生成加快糖尿病足創(chuàng)面的愈合。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取體質(zhì)量250～280 g的成年健康清潔級SD大鼠50只，均為雄性。飼養(yǎng)在溫度為(24±1)℃、相對濕度為45%～55%、12 h明暗周期環(huán)境中，自由飲水和進食。SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2實驗試劑 鏈脲佐菌素(S8050，索萊寶)，血糖試紙(HEA-STP30，歐姆龍)，大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(ab236712，Abcam)，大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(ab234570，Abcam)，大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(ab255730，Abcam)，大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒(ab100786，Abcam)，Trizol試劑(15596-026，Invitrogen)，TIANScript RT KIT (KR104-02，天根生物)，SuperReal PreMix Plus (FP205，天根生物)；根據(jù)《內(nèi)外傷辨惑論》，取黃芪30 g和當歸6 g，研磨后加水熬制成湯劑備用，即為當歸補血湯[9-10]。

1.3實驗儀器 血糖儀(HGM-114，歐姆龍)，多功能酶標儀(Varioskan LUX，ThermoFisher)，實時熒光定量PCR儀器(HM-PCR，恒美)。

1.4方法

1.4.1糖尿病足模型制備：大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，更換為高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1個月，禁食1 d，腹腔注射含1%鏈脲佐菌素的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.2，0.1 mol/L)[1]，注射劑量根據(jù)55 mg/kg計算，對照組注射同等體積的緩沖液。于第3天和第5天尾靜脈取血，檢測空腹血糖，若血糖值均>16.7 mmol/L則造模成功[6]。選取40只造模成功的糖尿病大鼠模型和10只對照大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，注射劑量根據(jù)0.3 ml/100 g計算，于右側足部背面造3 mm×3 mm矩形創(chuàng)口。

1.4.2分組與給藥：造模成功的糖尿病足大鼠模型隨機分為模型組、低劑量組(生藥濃度2 g/kg)、中劑量組(生藥濃度4 g/kg)、高劑量組(生藥濃度8 g/kg)，每組10只。當歸補血湯給藥方式為灌胃，每天1次，給藥量以1 ml/100 g計算。中劑量組給藥劑量(生藥濃度4 g/kg)是根據(jù)人使用量等劑量轉(zhuǎn)換，以此劑量為基礎，低劑量組減少50%，高劑量組增加1倍，觀察治療效果是否有劑量依賴效應。對照組和模型組的灌胃藥物替換為生理鹽水。給藥1周后處死動物，檢測相關指標。

1.4.3足部創(chuàng)面面積計算：在實驗終點對創(chuàng)面愈合情況進行拍照，應用IPP 6.0軟件測量并計算創(chuàng)面面積[3]。

1.4.4ELISA檢測：大鼠內(nèi)眥取血，分離血清約300 μl，實驗步驟嚴格參照ELISA試劑盒說明書，分別檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和VEGF含量。

1.4.5qRT-PCR檢測：采用實時熒光定量PCR檢測新生肉芽組織中的IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表達水平。取大鼠足部新生肉芽組織，面積約10 mm2，于液氮中凍存，采用Trizol法提取肉芽組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄參數(shù)如下：95℃預變性15 min，95℃退火10 s，58℃延伸30 s，共計40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表達水平采用2-ΔΔCt法計算。實驗均重復3次，取其平均值。IL-6、TNF-α、IL-1β、VEGF和β-actin的引物序列見表1。

2 結果

2.1當歸補血湯對糖尿病足大鼠足部創(chuàng)面愈合的影響 給藥1周后，各組足部創(chuàng)面愈合情況見圖1。對照組創(chuàng)面已結痂，基本愈合，創(chuàng)面面積(3.23±0.42)mm2；模型組創(chuàng)面部位紅腫，遠未達到愈合狀態(tài)，創(chuàng)面面積(17.15±2.31)mm2；低、中、高劑量組創(chuàng)面面積分別為(13.62±1.26)mm2、(9.44±0.83)mm2、(5.35±0.71)mm2，紅腫程度逐漸減輕。模型組創(chuàng)面面積大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。低、中、高劑量組創(chuàng)面面積均小于模型組，且隨著給藥劑量增大，創(chuàng)面面積逐漸變小，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

圖1 5組大鼠足部創(chuàng)面愈合情況

圖2 5組大鼠足部創(chuàng)面面積比較

2.2當歸補血湯對糖尿病足大鼠血清炎性細胞因子的影響 模型組血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于模型組，高劑量組低于中、低劑量組，中劑量低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表2和圖3。

圖3 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量比較

表2 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量

2.3當歸補血湯對糖尿病足大鼠血清VEGF含量的影響 對照組血清VEGF含量為(37.06±3.21)ng/L，模型組為(24.52±2.16)ng/L，低、中、高劑量組分別為(32.76±3.43)ng/L、(39.05±5.23)ng/L、(53.70±7.84)ng/L。模型組血清VEGF含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。低、中、高劑量組血清VEGF含量均高于模型組，高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 5組大鼠血清VEGF含量比較

2.4當歸補血湯對糖尿病足大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達的影響 模型組新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；低、中、高劑量組新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達均較模型組下降，高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表3和圖5。

圖5 5組大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平比較

表3 5組大鼠新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平

2.5當歸補血湯對糖尿病足大鼠新生肉芽組織VEGF mRNA表達的影響 對照組新生肉芽組織VEGF mRNA表達為2.85±0.12，模型組為0.67±0.06，低、中、高劑量組分別為0.89±0.08、1.23±0.10、2.24±0.13。模型組新生肉芽組織VEGF mRNA表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；低、中、高劑量組新生肉芽組織VEGF mRNA表達均較模型組升高，高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖6。

圖6 5組大鼠新生肉芽組織VEGF mRNA表達水平比較

3 討論

糖尿病足是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，在全世界范圍內(nèi)，是非創(chuàng)傷性截肢的主要原因，10%～15%的患者出現(xiàn)足部潰瘍[11-12]。而大多數(shù)糖尿病足患者不能及時治愈或愈合欠佳，常導致嚴重的并發(fā)癥，如皮膚、軟組織、骨骼或全身感染，甚至截肢[13-14]。造成糖尿病足創(chuàng)面愈合延遲的因素包括血糖水平高、胰島素抵抗、膠原蛋白沉積、血管生成障礙、血液供應減少和浸潤反應延遲等[2]。另外，創(chuàng)面部位炎性細胞浸潤、促炎細胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β)水平升高在糖尿病足的發(fā)展過程中起著重要作用[4-5]?；谝豁椙罢靶耘R床研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病相關的視網(wǎng)膜病變中，血清IL-1β、TNF-α和VEGF濃度對視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響，并且其含量與疾病的嚴重程度呈正相關[15]。還有研究表明，糖尿病引起的并發(fā)癥多與炎性細胞因子相關，抑制機體炎癥反應或是治療糖尿病并發(fā)癥的有效手段[16]。此外，有研究觀察到在糖尿病足綜合征患者中血管生成能力不足[17]。原因是糖尿病患者持續(xù)的高血糖水平會使HIF-1α失活，抑制VEGF的產(chǎn)生，導致糖尿病足創(chuàng)面愈合延遲[6]。一項隊列研究顯示，糖尿病足患者血清VEGF的含量高于對照組，但低于糖尿病對照者，并且VEGF-A的濃度增加與糖尿病足風險降低有關[18]。因此，抑制炎性細胞因子，增加創(chuàng)面血管的生成將是治療糖尿病足重要方法。

當歸補血湯的主要作用為補氣生血，主要用于產(chǎn)后血脫、勞傷血虛及瘡瘍潰后膿血過多等治療。在臨床中，已有中醫(yī)學者將當歸補血湯用于糖尿病足的治療，能夠促進潰瘍創(chuàng)面的修復[7-8]。在糖尿病足潰瘍大鼠模型中，黃芪可有效減小創(chuàng)面面積，抑制炎癥反應并促進成纖維細胞的增殖[19]。另外一項研究也顯示，當歸補血湯能有效改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病足大鼠模型肢端壞疽[20]。本研究結果顯示，當歸補血湯能有效降低糖尿病足大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量，以及創(chuàng)面新生肉芽組織TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達水平，從而抑制炎癥反應，促進創(chuàng)面的愈合。此外，當歸補血湯在血管生成方面能夠發(fā)揮重要作用，可通過VEGF途徑促進肝纖維化大鼠模型、心肌梗死大鼠模型和腦缺血再灌注損傷大鼠模型新生血管的生成[21-23]。但是，當歸補血湯能否在糖尿病足大鼠模型中發(fā)揮同樣的促進血管生成作用尚未證實。本研究發(fā)現(xiàn)，當歸補血湯可提高糖尿病足大鼠血清VEGF含量，并促進新生肉芽組織VEGF mRNA表達。因此，糖尿病足大鼠創(chuàng)面愈合可能與新生血管有關。

本研究也存在一定的不足，如藥物干預時間稍短。此外，糖尿病足潰瘍形成機制非常復雜，除炎癥反應和新生血管生成外，還可能涉及其他信號傳導通路。因此，針對糖尿病足潰瘍發(fā)病的機制，以及新治療手段和藥物的開發(fā)還需要深入探索。

綜上所述，當歸補血湯能有效下調(diào)糖尿病足大鼠模型TNF-α、IL-6和IL-1β的表達，上調(diào)VEGF表達；通過抑制炎癥反應和促進新生血管生成加快糖尿病足創(chuàng)面的愈合。