鹽脅迫對(duì)菌根化沙棗幼苗生長(zhǎng)性狀的影響1)

徐娜

(中國(guó)郵政集團(tuán)有限公司黑龍江省分公司，哈爾濱，150001)

宋福強(qiáng) 范曉旭 隋心 常偉

(黑龍江大學(xué))

土壤鹽漬化會(huì)改變土壤理化性質(zhì)，影響植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)、繁殖，從而導(dǎo)致植物生物量下降。全球作物每年因土壤鹽漬化減產(chǎn)超過(guò)20%。鹽堿地在我國(guó)分布廣泛，有接近7%的農(nóng)業(yè)耕地受到鹽堿化影響，迫切需求對(duì)鹽堿地的生態(tài)修復(fù)技術(shù)。

沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科多年生落葉喬木或小喬木。因?yàn)槠渚哂心秃?、耐鹽堿、耐貧瘠、抗風(fēng)沙等特點(diǎn)，已經(jīng)被列為我國(guó)荒漠沙地和鹽堿地造林綠化、土壤改良、生態(tài)改善的先鋒樹(shù)種。有關(guān)研究表明，沙棗可以在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽堿地正常生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)其種子萌發(fā)、水分與滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御等進(jìn)行測(cè)定，沙棗具有良好耐鹽性[1]。

叢枝菌根真菌(AMF)可以和80%的陸生植物建立叢枝菌根(AM)共生體，在提高植物抗逆能力、營(yíng)養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用方面，叢枝菌根比單獨(dú)的植物根系更具效率[2]。許多研究表明，叢枝菌根真菌能夠通過(guò)促生長(zhǎng)作用提高宿主植物耐鹽性。Giri et al.[3]研究表明，在鹽脅迫下，未接種叢枝菌根真菌聚生球囊霉(Glomusfasciculatum)的金合歡苗木，其根、莖的干質(zhì)量顯著下降，而接種叢枝菌根真菌有效促進(jìn)了金合歡苗木生長(zhǎng)；Porras-Soriano et al.[4]研究表明，接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)3種叢枝菌根真菌，能夠提高橄欖植株苗木在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)；Latef et al.[5]研究表明，在鹽脅迫下，與非接種處理相比，接種叢枝菌根真菌的番茄具有更高根莖葉的干質(zhì)量，更大葉面積和總生物量；另外，Khalil et al.[6]研究表明，在更高鹽脅迫下，接種根內(nèi)球囊霉的柑橘具有更高生物量；Borde et al.[7]研究表明，在適度鹽脅迫下，接種聚生球囊霉可顯著提高御谷(Pennisetumglaucum)的葉片數(shù)、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)。叢枝菌根真菌能夠有效提高宿主植物在鹽脅迫下的生物量，原因在于叢枝菌根真菌能夠增強(qiáng)宿主植物氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)獲取能力，改善了宿主植物在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)生理狀態(tài)。與單純使用耐鹽植物不同，作為一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效可行的鹽堿地治理新手段，叢枝菌根真菌技術(shù)在全球可持續(xù)農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)方面應(yīng)用的巨大潛力已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注。但是，目前關(guān)于叢枝菌根真菌是否能進(jìn)一步提高耐鹽植物的抗性，報(bào)道較少。本研究以實(shí)生沙棗苗木為供試植物、異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)為供試菌株，采用盆栽培養(yǎng)方法，設(shè)置不同濃度的NaCl脅迫菌根化沙棗幼苗，測(cè)定不同濃度NaCl脅迫的菌根化沙棗幼苗的株高、基徑、生物量、功能葉片生長(zhǎng)參數(shù)、鹽害癥狀，分析鹽脅迫對(duì)菌根化植物生長(zhǎng)的影響，旨在為利用耐鹽植物聯(lián)合菌根生物技術(shù)進(jìn)行鹽堿地生物治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試沙棗(E.angustifoliaL.)品種錦繡1號(hào)，由黑龍江錦繡大地生物工程有限公司提供，該品系于2011年經(jīng)黑龍江省林業(yè)廳鑒定，具有較強(qiáng)的耐鹽堿和耐寒能力。

供試叢枝菌根真菌(AMF)菌種：選擇能夠提高宿主植物耐鹽性的異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)，獲批專(zhuān)利ZL201510232876.3，菌劑中叢枝菌根真菌孢子量為25～30個(gè)/g。由黑龍江大學(xué)修復(fù)生態(tài)研究室篩選、擴(kuò)繁及保存。

苗木培養(yǎng)基質(zhì)的土壤，取自黑龍江省森林植物園(地理中心坐標(biāo)：東經(jīng)126°16′、北緯45°45′)。土壤過(guò)直徑5 mm篩，按體積比與蛭石混合均勻(V(土壤)∶V(蛭石)=3∶1)，經(jīng)3次高溫高壓滅菌(0.1 MPa，121 ℃，1 h)處理，等量分裝至花盆(規(guī)格為33 cm×16 cm×15 cm)中。培養(yǎng)基質(zhì)初始性質(zhì)：pH=7.2，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，有效氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)123.4 mg/kg，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.6 mg/kg，有效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.5 mg/kg，電導(dǎo)率0.5 dS/m。

1.2 試驗(yàn)方法

采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，包含2個(gè)因素：叢枝菌根菌劑接種處理，不接種的對(duì)照處理(NM)、異形根孢囊霉接種處理(M)；NaCl脅迫處理，0、100、200、300 mmol·L-1NaCl。每個(gè)處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)(見(jiàn)表1)。

表1 菌根化沙棗苗木盆栽鹽處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)

沙棗種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.2%的KMnO4溶液表面消毒處理10 min，無(wú)菌蒸餾水潤(rùn)洗4次，播種于花盆中。叢枝菌根菌劑接種處理，接種量10 g/盆；對(duì)照處理，每盆接10 g滅活叢枝菌根真菌菌劑。定期檢測(cè)叢枝菌根真菌侵染情況，當(dāng)菌根侵染率達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行NaCl脅迫處理。為避免對(duì)苗木產(chǎn)生滲透休克，分2次進(jìn)行鹽脅迫處理，間隔期7 d，每次每盆施鹽溶液1.5 L。完成鹽脅迫后的30 d取樣，用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

菌根侵染率測(cè)定：參考采用醋酸墨水染色法將根段染色[8]，依據(jù)特魯夫洛(Trouvelot)的方法[9]計(jì)算菌根侵染率，菌根侵染率=(有菌根根段數(shù)/總根段數(shù))×100%。

株高、基徑測(cè)量：每個(gè)處理中隨機(jī)選取沙棗苗木20株，以米尺測(cè)量株高(精確至0.1 cm)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定基徑(精確至0.01 mm)。

生物量積累與分配：每個(gè)處理中隨機(jī)選取沙棗苗木20株，將單株沙棗苗木根、莖、葉分別收集，105 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘干至恒質(zhì)量，自然冷卻；電子天平稱(chēng)量沙棗苗木根、莖、葉的干質(zhì)量(精確至0.001 g)，計(jì)算全株總生物量、冠生物量、生物量分配比例。全株總生物量=根的干物質(zhì)量+莖的干物質(zhì)量+葉的干物質(zhì)量；冠生物量=莖生物量+葉生物量；生物量分配比例=(各組織生物量/相應(yīng)處理植株的平均總生物量)×100%。

葉片參數(shù)調(diào)查和測(cè)定：隨機(jī)選取每個(gè)處理沙棗苗木20株，計(jì)數(shù)每株苗木的脫落葉片數(shù)量、枯黃葉片數(shù)量、完全展開(kāi)功能葉片數(shù)量。其中，已經(jīng)脫落或輕微觸碰而脫落的葉片為脫落葉片，除全綠和僅葉尖枯黃以外的完全展開(kāi)葉片為枯黃葉片，面積≥1 cm2的完全展開(kāi)葉片為功能葉片。葉片脫落率=[脫落葉數(shù)/(脫落葉數(shù)+枯黃葉數(shù)+功能葉數(shù))]×100%；葉片枯黃率=[枯黃葉數(shù)/(脫落葉數(shù)+枯黃葉數(shù)+功能葉數(shù))]×100%；葉片鹽害率=[(脫落葉數(shù)+枯黃葉數(shù))/(脫落葉數(shù)+枯黃葉數(shù)+功能葉數(shù))]×100%。

將每個(gè)處理的20株完全展開(kāi)的葉片分單株收集于自封袋內(nèi)。用掃描儀掃描葉片，根據(jù)葉面積計(jì)算軟件(1.1版本)，計(jì)算各單株的總?cè)~面積，記錄葉片數(shù)量，并計(jì)算單葉面積、比葉面積、葉面積比率。單葉面積=總?cè)~面積/總?cè)~數(shù)；比葉面積=總?cè)~面積/葉片的干物質(zhì)量；葉面積比率=總?cè)~面積/全株的干物質(zhì)量。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法：采用Microsoft Excel 2003、GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。相同鹽濃度脅迫處理的叢枝菌根真菌接種(M)和非接種(NM)處理之間的差異性，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析(P<0.05)。不同鹽濃度脅迫處理之間的差異性，用單因素方差分析中的鄧肯檢驗(yàn)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對(duì)沙棗幼苗的侵染

異形根孢囊霉能夠侵染并定殖于沙棗苗木根部。沙棗苗木接種異形根孢囊霉3個(gè)月后，菌根侵染率均達(dá)到90%以上，經(jīng)顯微鏡鏡檢觀(guān)察，可清晰觀(guān)察到沙棗菌根根內(nèi)菌絲、泡囊和叢枝結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。

圖1 沙棗菌根根內(nèi)菌絲、泡囊和叢枝顯微結(jié)構(gòu)

2.2 鹽脅迫對(duì)菌根化沙棗苗木株高和基徑的影響

經(jīng)過(guò)30 d鹽脅迫，無(wú)論是否接種叢枝菌根真菌，鹽脅迫均對(duì)沙棗苗木生物量產(chǎn)生明顯抑制作用，顯著降低沙棗苗木株高、基徑(P<0.05，見(jiàn)表2)。鹽濃度為100、200、300 mmol·L-1時(shí)：M處理、NM處理的沙棗苗木，株高總體均呈下降趨勢(shì)，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木的株高(P<0.05)，增加幅度分別為9.68%、13.53%、11.30%；M處理、NM處理的沙棗苗木，基徑均呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木的基徑(P<0.05)，增加幅度分別為7.79%、6.67%、4.35%。

表2 經(jīng)鹽脅迫和接種叢枝菌根真菌的沙棗苗木株高和基徑

2.3 鹽脅迫對(duì)菌根化沙棗苗木生物量的影響

經(jīng)過(guò)30 d鹽脅迫，無(wú)論是否接種叢枝菌根真菌，鹽脅迫均對(duì)沙棗生物量產(chǎn)生明顯抑制，根、莖、葉的干質(zhì)量和總生物量均在最高濃度鹽脅迫時(shí)最低；但同一鹽濃度處理時(shí)，M處理沙棗苗木生物量顯著高于NM處理的(見(jiàn)表3)。

在無(wú)鹽脅迫時(shí)，接種叢枝菌根真菌顯著提高沙棗苗木根生物量、莖生物量、葉生物量、冠生物量、全株總生物量(P<0.05)，其中根的干質(zhì)量增加19.05%、冠生物量增加24.44%、全株總生物量增加23.86%。

隨著濃度升高的鹽脅迫，M處理、NM處理沙棗苗木根的干質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木根的干質(zhì)量與無(wú)鹽脅迫處理的相比，分別降低16.00%、34.00%、 52.00%。相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木根的干質(zhì)量均顯著高于NM處理的，分別增加23.53%、26.92%、100.00%。

隨著鹽脅迫程度提高，M處理、NM處理沙棗苗木冠生物量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理時(shí)，M處理沙棗苗木冠生物量比無(wú)鹽脅迫沙棗苗木冠生物量，分別降低15.48%、37.50%、60.12%。相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木冠生物量均顯著高于NM處理的。100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理時(shí)，M處理沙棗苗木冠生物量比NM處理的，分別增加39.22%、64.06%、109.38%。

隨著鹽濃度不斷提高，M處理、NM處理沙棗苗木全株總生物量均顯著降低(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木全株總生物量比無(wú)鹽脅迫的，分別降低15.60%、37.16%、58.72%。相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木全株總生物量均顯著高于NM處理的，100、200、300 mmol·L-1NaCl濃度處理時(shí)，分別增加了36.30%、52.22%、104.54%。

2.4 鹽脅迫對(duì)菌根化沙棗苗木功能葉生長(zhǎng)的影響

無(wú)鹽脅迫時(shí)，接種叢枝菌根真菌顯著提高了沙棗苗木單葉面積、比葉面積、葉面積比率(P<0.05)，分別增加了27.86%、14.91%、15.58%(見(jiàn)表4)。

M處理、NM處理沙棗苗木，均隨著鹽脅迫程度加劇顯著降低了苗木單葉面積、比葉面積、葉面積比率(P<0.05，見(jiàn)表4)。其中，100、200、300 mmol·L-1鹽脅迫處理時(shí)，M處理沙棗苗木單葉面積比無(wú)鹽脅迫的，分別降低22.37%、41.44%、63.81%。相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木單葉面積均顯著高于NM處理的(P<0.05)，100、200、300 mmol·L-1鹽脅迫處理時(shí)，分別增加19.46%、40.65%和138.46%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木的比葉面積，比無(wú)鹽脅迫的分別降低26.10%、42.50%、63.32%；相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木比葉面積均顯著高于NM處理的(P<0.05)，分別增加3.37%、34.96%、30.90%。

100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，M處理沙棗苗木葉面積比率，比無(wú)鹽脅迫的分別降低28.51%、42.91%、58.01%；相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木葉面積比率均顯著高于NM處理的(P<0.05)，分別增加6.94%、51.48%、130.27%。

經(jīng)過(guò)30 d鹽脅迫，對(duì)不同濃度鹽脅迫處理的沙棗苗木葉片受害情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表5)，在無(wú)鹽脅迫時(shí)，M處理、NM處理沙棗苗木下部老葉均出現(xiàn)一定程度脫落、枯黃。隨著濃度升高的鹽脅迫，M處理、NM處理的沙棗苗木植株，葉片脫落率、枯黃率、鹽害率總體上均呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)。其中，100、200、300 mmol·L-1NaCl脅迫處理，導(dǎo)致M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率均顯著升高，各濃度鹽處理之間呈顯著差異(P<0.05)。相同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率均顯著低于NM處理的(P<0.05)。

表5 經(jīng)鹽脅迫和接種叢枝菌根真菌的沙棗苗木葉片脫落率和枯黃率

3 討論

鹽脅迫會(huì)顯著抑制植物生長(zhǎng)，因此，植物面臨鹽脅迫時(shí)，自身是否能夠維持正常生長(zhǎng)狀態(tài)是衡量其耐鹽能力的重要指標(biāo)之一。叢枝菌根真菌能夠幫助植物改善生長(zhǎng)生理狀態(tài)，緩解鹽脅迫壓力[10]。本研究表明，在同等鹽脅迫條件下，接種異形根孢囊霉顯著改善沙棗苗木生長(zhǎng)狀態(tài)，提高了株高、基徑、根生物量、莖生物量、葉生物量、冠生物量、總生物量，通過(guò)維持較高生物量，有效稀釋Na+等有害鹽離子濃度，減弱了鹽脅迫對(duì)植物毒害作用。鹽脅迫時(shí)，菌根沙棗苗木表現(xiàn)出更高生物量，這與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的諸多叢枝菌根真菌-植物共生體耐鹽脅迫研究結(jié)果相一致[11-12]。

根系是植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)成分的重要器官。植物根系是與鹽堿、干旱、重金屬等外源非生物脅迫因子最直接關(guān)聯(lián)的器官組織，鹽脅迫能抑制植物根系生長(zhǎng)，降低植物根系表面積。叢枝菌根真菌通過(guò)與宿主植物根系結(jié)合，建立共生體系后，會(huì)促進(jìn)根系發(fā)育，改變植物根系構(gòu)型，增加根系生物量。因此，叢枝菌根真菌能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，與其促進(jìn)根系發(fā)育、改善宿主植物根系形態(tài)特征有著密不可分的關(guān)系。目前諸多研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，為了更有利于宿主植物吸收水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌根化植物往往具有更發(fā)達(dá)根系，以維持光合作用和生物量積累[3，5，13-14]。本研究中，鹽脅迫顯著降低了沙棗苗木根的生物量，接種異形根孢囊霉提高了沙棗苗木根系生物量，促進(jìn)了根系生長(zhǎng)，這有利于植物更好地適應(yīng)鹽脅迫。

植物受鹽脅迫，導(dǎo)致葉面積減小，伴隨莖生長(zhǎng)減緩，光合速率降低，繼而降低整體生物量。本研究中，鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木冠生物量下降幅度小于NM處理的，表明接種異形根孢囊霉有效緩解了鹽脅迫對(duì)莖葉生長(zhǎng)的抑制作用，菌根化沙棗苗木對(duì)鹽脅迫的耐受能力更強(qiáng)。

葉片是植物光合作用的重要器官組織，單葉面積指標(biāo)與生物量積累能力密切相關(guān)，比葉面積、葉面積比率能夠衡量植物在不同生境的環(huán)境資源獲取能力。本研究中，在不同濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木單葉面積下降幅度小于NM處理的，并且在相同濃度鹽脅迫時(shí)，菌根化沙棗苗木單葉面積顯著高于非菌根化沙棗苗木的；且菌根化沙棗苗木比葉面積、葉面積比率，顯著高于相同鹽處理的非菌根化沙棗苗木的，這表明，鹽脅迫的菌根化沙棗苗木具有更強(qiáng)光合作用能力，以提高生物量積累。植物葉片脫落、枯黃狀態(tài)是鹽脅迫的植物生長(zhǎng)狀態(tài)最直接體現(xiàn)，本研究中，高濃度鹽脅迫時(shí)，M處理沙棗苗木葉片脫落率、枯黃率、鹽害率顯著低于NM處理的，說(shuō)明接種異形根孢囊霉在一定程度上緩解了鹽脅迫對(duì)沙棗苗木植株的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。

本研究表明，接種叢枝菌根真菌異形根孢囊霉，不但對(duì)鹽脅迫的沙棗幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，而且還可以增強(qiáng)其耐鹽脅迫能力。這可為鹽堿地資源開(kāi)發(fā)利用和綜合生態(tài)治理、把黑龍江省現(xiàn)有鹽堿地變成綠洲、對(duì)沙棗這一林業(yè)潛在資源進(jìn)行后期產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)提供參考。