李雁羽 劉天潤 吳 啟 王 磊

（安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 安徽合肥 230036）

透明骨骼標本是通過透明劑、染色劑、脫色劑的處理，讓動物肌肉組織透明化，骨骼由染色劑凸顯出形狀的標本[1-3]。染色劑中的茜素紅可特異性與硬骨中的鈣結(jié)合，讓其呈現(xiàn)紅色，而阿利新藍在合適的pH 值下可讓軟骨中硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等主要成分呈現(xiàn)藍色。二者配合使用，可讓觀察者透過肌肉組織直觀地觀察動物體內(nèi)硬骨和軟骨的結(jié)構(gòu)和分布[4]。

為了讓包埋劑起到更好的包埋效果，需對透明骨骼標本進行塑化處理，而聚乙二醇可用于簡易塑化標本的制作[5-6]。PEG-600，即分子量為600的聚乙二醇，常溫下為液態(tài)，是水溶性聚合物，利用梯度浸漬的方法可讓PEG-600 對生物標本起到較好的塑化作用。傳統(tǒng)的包埋標本使用的AB膠（室溫固化環(huán)氧樹脂）固化時間較長，UV 膠（又稱“紫外光固化膠”）是一種必須通過紫外光照射才能固化的膠粘劑，固化速度快，透光性強，它作為包埋劑已應(yīng)用于植物標本制作領(lǐng)域[7]。

本研究工作主要通過塑化技術(shù)處理透明骨骼標本，再利用UV 膠的紫外固化特性實現(xiàn)快速包埋，改良了透明骨骼標本的保存方法，使其便于運輸，促進其實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用[8-9]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 出生2～4 d 的小鼠、無水乙醇、丙酮、茜素紅、阿利新藍、氫氧化鉀、甘油、PEG-600、UV 膠、長方體硅膠模具（大小：50 mm×85 mm×50 mm）。

1.2 實驗方法

1）初步處理方法。處死小鼠，剝離皮膚，在接近肢端時不要剝離皮膚，避免損傷小鼠趾端和尾部的結(jié)構(gòu)，去除其內(nèi)臟，并用清水沖洗干凈。

2）試劑配制方法。A 液：茜素紅原液。在質(zhì)量分數(shù)95%的乙醇溶液中加入茜素紅直至飽和。

B 液：茜素紅應(yīng)用液。將A 液與體積分數(shù)70%的乙醇溶液以體積比1∶9 的比例混合均勻，再加入等體積的質(zhì)量分數(shù)1%的KOH 溶液，即配制成茜素紅應(yīng)用液。

C 液：阿利新藍軟骨染液。10 mg 阿利新藍、80 mL 體積濃度95%的乙醇溶液、20 mL 冰醋酸，混合均勻，靜置一夜后次日使用。

D 液：預(yù)透明液。質(zhì)量分數(shù)2%的KOH 溶液。

E 液：透明液Ⅰ。氫氧化鉀1 g、甘油20 g，加蒸餾水至1 000 mL。

F 液：透明液Ⅱ。甘油與蒸餾水1∶1 混合。

1.3 透明骨骼標本制作

1）脫水固定。將初步處理的材料依次放入80%、90%、100%3 個濃度梯度的乙醇中浸泡，每個濃度浸泡24 h?？筛鶕?jù)標本大小及實際的脫水情況，增減每個濃度浸泡的時間。

2）脫脂。將脫水固定之后的標本放入丙酮中進行脫脂，時間為1～3 d，脫脂完成后將標本使用清水浸泡，直至標本沉底。

3）軟組織染色。將脫脂完成的材料在C 液中浸泡1～2 d。具體浸泡的時間，可根據(jù)標本的染色情況靈活地進行調(diào)整。可檢查腕關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等處是否上色，以此確定是否繼續(xù)染色。

4）復(fù)水。將標本從C 液中取出，置于無水乙醇中1～3 d。而后將標本從無水乙醇中取出，依次浸泡于95%、75%、45%、15%的梯度濃度乙醇溶液中，在每個梯度浸泡至標本在容器中沉底為止，最后浸泡于蒸餾水中。

5）預(yù)透明。將復(fù)水之后的材料置于D 液中進行預(yù)透明。預(yù)透明的作用是脫色和提升后續(xù)試劑的穿透能力，預(yù)透明的時長把握很重要，一般在隱約可見骨骼，肌肉呈果凍狀時停止預(yù)透明。

6）硬骨染色。將標本置于B 液中浸泡，直至硬骨被染成紫紅色為止。浸泡時間一般為1 d，需根據(jù)標本是否剝皮，預(yù)透明程度等實際情況靈活調(diào)整染色時間。

7）分色及再度透明。將標本在E 液中浸泡1～2 d，而后入F 液中浸泡，直至標本肌肉組織脫色，可觀察到被染色的骨骼結(jié)構(gòu)為止。

8）甘油梯度透明。將標本依次浸入體積分數(shù)為40%、50%、60%、80%的甘油各2 d，然后浸入純甘油浸泡，直至肌肉無色透明，骨骼結(jié)構(gòu)清晰可見為止。

9）塑化。選擇PEG-600 作為塑化劑。向質(zhì)量分數(shù)0.5%的氫氧化鉀溶液加入幾粒麝香草酚晶體，充分混合。再加入適量PEG-600，分別配制成體積濃度為15%、25%、50%、75%、100%的PEG-600 溶液，將標本依次放入其中浸泡。15%濃度時浸泡1～2 d，后續(xù)每個梯度的浸泡時間為2～3 d，這樣即可使PEG-600完全替換其中的甘油，完成塑化。

10）包埋。向硅膠模具中傾倒UV 膠，待其沒過模具底部1 cm 左右時停止傾倒，將模具置于紫外線照射環(huán)境中。待底層的UV 膠固化之后，將塑化好的標本放入模具，調(diào)整姿勢，再灌注UV膠，直至沒過標本1 cm 左右。將模具置于紫外線照射環(huán)境下，待UV 膠完全固化之后，將包埋好的標本脫模取出即可。

圖1 小鼠不同制作時期的透明骨骼塑化包埋標本

2 結(jié)果

2.1 標本整體效果 所制的小鼠標本顯著地展示了硬骨和軟骨的分布情況（圖2），肋軟骨、關(guān)節(jié)軟骨、鼻軟骨等軟骨被染成藍色，肱骨、脊椎、肩胛骨等硬骨被染成紅色，尚未完全硬骨化的尾椎為淡紅色（圖3、圖4）。標本被UV 膠包埋，堅固透明，便于運輸和觀察骨骼結(jié)構(gòu)，具有很好的觀賞價值和科學教育價值。

圖2 小鼠透明骨骼塑化包埋標本正面圖

圖3 標本軀干前部細節(jié)圖

圖4 標本軀干后部細節(jié)圖

2.2 UV 膠固化效果 傳統(tǒng)包埋標本所使用的AB 膠在室溫條件下，完全固化需要1 d 左右。本文采用的UV 膠，在紫外光照射下發(fā)生紫外固化反應(yīng)，凝固速度可控，節(jié)省成本，更適合于批量生產(chǎn)包埋標本。在本次小鼠標本的制作過程中使用太陽光照射，5 min 左右即可觀察到表面固化現(xiàn)象，1 h 后即達到較好的固化效果，固化完成的包埋標本堅固又透明。

3 討論

制作標本的原料盡可能選擇幼體或體型較小的個體，因為成年個體的肌肉發(fā)達，各種試劑不易穿透，不利于標本制作。制作透明骨骼標本時梯度濃度浸泡是一種常用技術(shù)，在脫水固定步驟中，不使用無水乙醇直接浸泡標本的原因是該操作會使標本快速脫水而硬化皺縮，不利于美觀和后續(xù)的實驗操作[10]。

聚乙二醇在小型動物的簡易塑化方面有著廣泛地應(yīng)用。這種水溶性高分子材料制作出的塑化標本具有防腐、防霉的特征[11-12]。

本研究不足之處是由于初次操作，制作完成的標本中含有微小的氣泡。對此的解決方法是對標本進行紫外線照射之前，用真空泵除去氣泡。并且由于丙酮脫脂不充分，小鼠的肩部脂肪沒有去除干凈，影響對頸椎的觀察（圖3）。在今后的制作過程中，將不斷完善技術(shù)流程以制備更好的骨骼標本，以適應(yīng)教學及商業(yè)化的要求。