劉玲玲, 李冰寧, 武彥文
(北京市理化分析測試中心, 北京市食品安全測試工程技術(shù)研究中心, 北京 100094)
石油作為能源和化學(xué)工業(yè)的原材料在全球的應(yīng)用十分普遍,然而,其開采、運(yùn)輸、儲存等過程均可能對環(huán)境造成污染風(fēng)險(xiǎn),此外,一些人為因素導(dǎo)致的環(huán)境污染也不容忽視,如油罐泄露、油輪事故、廢水排放等[1]。烴類污染物不易降解,會持續(xù)影響生態(tài)系統(tǒng)和人類健康。因此,土壤中的石油污染一直是環(huán)境監(jiān)測的重點(diǎn)[2,3]。
石油的化學(xué)組成非常復(fù)雜,包含不同結(jié)構(gòu)類型的碳?xì)浠衔?即烴類化合物。石油烴的結(jié)構(gòu)類型包括直鏈或支鏈脂肪族、脂環(huán)族和高度烷基化的芳香族,其中,直鏈或支鏈脂肪族、脂環(huán)族統(tǒng)稱為飽和烴(saturated hydrocarbons, SH),含有烷基化芳香族則統(tǒng)稱為芳香烴(aromatic hydrocarbons, AH)[4,5]。由于石油烴的碳數(shù)從十幾到幾十,因此其包含的化合物數(shù)量巨大,無法將其分離成單個(gè)物質(zhì)分析,只能進(jìn)行總量測定。紅外光譜法、紫外和熒光分光光度法等分子光譜分析方法均曾經(jīng)用于石油烴的總量測定[6-9],但均存在局限性。紫外和熒光方法只能測定芳香烴,紅外光譜法雖然可以同時(shí)測定飽和烴和芳香烴,但需要使用劇毒的四氯化碳或四氯乙烯。更為關(guān)鍵的是,由于石油烴的污染來源復(fù)雜且多樣,不同樣品中石油烴的化學(xué)組成迥異,無法找到合適的標(biāo)準(zhǔn)品與之匹配。分子光譜法缺乏與目標(biāo)物匹配的標(biāo)準(zhǔn)品,其測定結(jié)果無法真實(shí)反映實(shí)際情況。氫火焰離子化檢測器(FID)對烴類物質(zhì)的響應(yīng)幾乎完全一致,因而其定量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品無關(guān),只需任一烴類化合物作為內(nèi)標(biāo)即可對不同來源的石油烴污染物進(jìn)行準(zhǔn)確定量[10]。因此,近年來氣相色譜法(GC)成為環(huán)境中石油烴分析的新標(biāo)準(zhǔn)[11-16]。
然而,GC-FID缺乏選擇性,無法區(qū)分飽和烴與芳香烴,石油烴中不同組分的毒性差別很大,如飽和烴有蓄積作用,導(dǎo)致微型肉芽腫的形成,而芳香烴可能致畸和致癌風(fēng)險(xiǎn)[17]。為了分別測定飽和烴和芳香烴,美國馬薩諸塞州的標(biāo)準(zhǔn)方法是將樣品通過二氯甲烷萃取,經(jīng)硅膠柱分離得到飽和烴和芳香烴[5]。不過,該方法消耗溶劑多、步驟繁瑣、操作難度較大。目前,食品領(lǐng)域采用在線聯(lián)用高效液相色譜-氣相色譜(on-line high performance liquid chromatography-gas chromatography, HPLC-GC)技術(shù)測定其中的礦物油污染物,該技術(shù)有效整合了烴類分析中的凈化、分離與檢測步驟,其中HPLC的硅膠柱可以吸附油脂等極性物質(zhì),同時(shí)分離飽和烴和芳香烴,然后通過閥切換、預(yù)柱與溶劑排空閥組成的HPLC-GC接口,將分離出來的飽和烴和芳香烴全部送入GC分析,真正實(shí)現(xiàn)了全樣品分析,從而極大地提升了分析靈敏度;此外,這套系統(tǒng)通常配置兩套完全相同的通道(每個(gè)通道均由一套預(yù)柱、三通、溶劑放空閥、分析柱和FID組成),一次進(jìn)樣即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)飽和烴和芳香烴的測定,成倍地提高了分析效率。HPLC-GC的應(yīng)用有效減少了樣品量和試劑消耗,簡化了實(shí)驗(yàn)步驟,避免了污染引入,從而提高了方法的準(zhǔn)確性和結(jié)果的重現(xiàn)性[10,18]。我們前期將該技術(shù)成功運(yùn)用于奶粉、大米、巧克力等食品中礦物油的測定[19-21],結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同樣品的基質(zhì)干擾不同,其涉及的提取與凈化方法各有差異。以提取方法為例,大部分干物質(zhì)可以直接用正己烷浸泡提取,濕物質(zhì)則需要事先去除水的干擾,而一些噴霧干燥的樣品則需要水解處理才能提取完全[22],等等。本研究將HPLC-GC用于土壤中飽和烴與芳香烴的測定,需要根據(jù)土壤基質(zhì)的干擾情況對樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。首先本文對提取方法進(jìn)行了考察和優(yōu)化,包括提取溶劑、時(shí)間、溫度和次數(shù)等提取條件;其次,由于HPLC-GC中HPLC硅膠柱的吸附容量有限,本文增加離線的固相萃取(SPE)凈化步驟,考察優(yōu)化了去除提取液中油脂等極性干擾物的凈化條件;最后,采用HPLC-GC技術(shù)建立了同時(shí)測定土壤中飽和烴和芳香烴的方法。此外,本文還通過譜圖分析探索了石油烴的污染來源,這些均為了解環(huán)境中石油烴的污染情況與制定治理策略提供數(shù)據(jù)支撐。
HPLC-GC聯(lián)用儀器:包括配備二元泵和UV檢測器的LC 20A液相色譜儀,帶有FID的GC 2010 plus氣相色譜儀(日本Shimadzu公司), HPLC-GC接口(德國Axel Semrau公司)和PAL自動進(jìn)樣器(瑞士CTC公司)。
正己烷、二氯甲烷、無水乙醇、甲苯均為色譜純(美國Fisher Scientific公司);無水硫酸鈉為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);硅膠(0.063~0.200 mm),使用前400 ℃下活化16 h(德國Merck公司)。
SQC-116的土壤石油烴標(biāo)準(zhǔn)物(標(biāo)準(zhǔn)值2 541 mg/kg,可信區(qū)間938~3 750 mg/kg)購自美國NSI Lab solutions公司;9種飽和烴/芳香烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(15~60 mg/L,溶劑是正己烷和/或甲苯,分別作為內(nèi)標(biāo)使用):正十三烷(n-C13)的質(zhì)量濃度為15 mg/L,正十一烷(n-C11)、環(huán)己基環(huán)己烷(Cycy)、戊基苯(5B)、1-甲基萘(1-MN)、2-甲基萘(2-MN)、1,3,5-三叔丁基苯(TBB)的質(zhì)量濃度均為30 mg/L, 5α-膽甾烷(Cho)和苝(Per)的質(zhì)量濃度均為60 mg/L,以上9種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以及C7~C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 mg/L)均購自美國Sigma-Aldrich公司。其中n-C11和5B分別用于飽和烴和芳香烴部分的揮發(fā)損失考察;Cycy和2-MN分別為飽和烴和芳香烴的定量內(nèi)標(biāo);n-C13和1-MN用于考察內(nèi)標(biāo)物Cycy和2-MN的響應(yīng)信號的準(zhǔn)確性;此外,Cho、TBB和Per用于監(jiān)控HPLC分離情況,它們分別為飽和烴流分的末端、芳香烴的開端與末端標(biāo)記物。
1.2.1試樣提取
稱取5.0 g土壤樣品,加入20 mL正己烷-乙醇(1∶1, v/v)混合試劑和30 μL飽和烴/芳香烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,振蕩1 h,然后加入20 mL去離子水,水洗去乙醇,取正己烷相。
1.2.2試樣凈化
將2 g活化硅膠裝入玻璃層析柱,硅膠頂部覆蓋1 g無水硫酸鈉,以10 mL正己烷-二氯甲烷混合溶劑(8∶2, v/v)平衡柱床,然后加入上述提取液,待液面近干,以10 mL左右的正己烷-二氯甲烷混合溶劑(8∶2, v/v)淋洗,收集洗脫液并濃縮至約1 mL,注入HPLC-GC分析。
1.3.1HPLC條件
Allure Si色譜柱(250 mm×2.1 mm, 5 μm, 6 nm,美國Restek公司);流動相A為正己烷,B為二氯甲烷;梯度洗脫:0~0.1 min, 100%A(流速為0.3 mL/min); 0.1~6.2 min, 70%A(流速為0.3 mL/min); 6.2~15.2 min, 100%B(反沖,流速為0.5 mL/min); 15.2~25.2 min, 100%A(流速為0.5 mL/min); 25.2~30 min, 100%A(流速為0.3 mL/min)。HPLC運(yùn)行過程的流動相變換與飽和烴/芳香烴流出通過紫外檢測器(230 nm)監(jiān)測,進(jìn)樣量為50 μL。
1.3.2HPLC-GC接口
基于HPLC-GC聯(lián)用技術(shù)[21],經(jīng)HPLC分離后分別得到450 μL的飽和烴(2.0~3.5 min)和芳香烴(4.5~6.0 min)。兩段流分通過閥切換,以氫氣為載氣被導(dǎo)入GC分析。GC儀器配備了由預(yù)柱(Restek MXT無涂層毛細(xì)管預(yù)柱,10 m×0.53 mm)和分析柱(Restek MXT毛細(xì)管柱,15 m×0.25 mm×0.25 μm)組成的兩個(gè)平行通道。飽和烴和芳香烴各自進(jìn)入一個(gè)通道,預(yù)柱與分析柱之間通過三通與溶劑排空閥連接。溶劑排空閥在LC流分閥切換前0.5 min開啟,轉(zhuǎn)移結(jié)束后0.3 min關(guān)閉。轉(zhuǎn)移到GC系統(tǒng)的飽和烴和芳香烴中大部分溶劑通過溶劑排空閥去除,剩余少量溶劑與濃縮的溶質(zhì)聚集在分析柱入口,進(jìn)行后續(xù)GC分離和測定。
1.3.3GC條件
程序升溫的初始溫度60 ℃(保持6 min),以15 ℃/min升溫至120 ℃,再以25 ℃/min升溫至370 ℃(保持6 min)。FID溫度為380 ℃;輔助氣、燃燒氣和助燃?xì)夥謩e為氮?dú)?、氫氣和空?流速分別為30、40和400 mL/min。
飽和烴和芳香烴在GC-FID譜圖中均呈一定沸程范圍的駝峰,定量計(jì)算時(shí),飽和烴/芳香烴的含量通過計(jì)算譜圖基線與駝峰之間的面積得到,基線取決于樣品空白的GC譜圖;駝峰上方的內(nèi)標(biāo)物尖峰定量計(jì)算時(shí)扣除[10]。采用內(nèi)標(biāo)法對飽和烴/芳香烴進(jìn)行定量,飽和烴的定量內(nèi)標(biāo)物為環(huán)己基環(huán)己烷(Cycy),芳香烴的定量內(nèi)標(biāo)物為2-MN。
除不加土壤樣品外,按照1.2節(jié)和1.3節(jié)進(jìn)行操作,得到樣品空白實(shí)驗(yàn)的HPLC-GC譜圖,該譜圖不含干擾石油烴測定的駝峰,基線近似平直,基線偏移的高度與石油烴信號的高度之比不超過四分之一。
2.1.1提取溶劑的選擇
根據(jù)相似相溶原理,正己烷、正庚烷、二氯甲烷等弱極性溶劑可用于提取石油烴。由于土壤中含有不同程度的水分,土壤顆粒孔隙中的水會阻止石油烴擴(kuò)散至提取溶劑,因而需要對濕樣品進(jìn)行事先脫水。然而,通常采用的蒸發(fā)脫水容易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性烴類物質(zhì)的損失。因此,通過加入與水互溶的極性溶劑,利用其滲透固體顆粒表面的水層來促進(jìn)濕樣品中石油烴的溶出。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 16703采用丙酮-正庚烷(2∶1, v/v)或非極性溶劑(如石油醚、環(huán)己烷、正己烷等)提取土壤中的石油烴[4];美國標(biāo)準(zhǔn)EPA 3540C規(guī)定土壤/沉積物的提取溶劑采用正己烷-丙酮(1∶1, v/v)或二氯甲烷-丙酮(1∶1, v/v)[23];我國環(huán)境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ 1021-2019《土壤沉積物石油烴(C10~C40)的測定 氣相色譜法》選用正己烷-丙酮(1∶1, v/v)或正己烷作為提取溶劑[16]。
由于正庚烷的沸點(diǎn)較高,為98.5 ℃,去除溶劑時(shí)需要的時(shí)間較長;丙酮屬于易制毒品,購買受到限制;二氯甲烷則被列入《優(yōu)先控制化學(xué)品名錄》,應(yīng)最大限度減少生產(chǎn)和使用。因此,選取正己烷替代正庚烷和二氯甲烷,以乙醇替代丙酮作為石油烴提取溶劑。本文分別考察和對比了正己烷和正己烷-乙醇(1∶1, v/v)的提取效果。結(jié)果表明:正己烷-乙醇(1∶1, v/v)的提取效率(13.9 mg/kg)明顯優(yōu)于正己烷的(5.8 mg/kg)(色譜圖見圖1);同時(shí)乙醇的毒性很低,故本研究選取正己烷-乙醇(1∶1, v/v)作為土壤中石油烴的提取溶劑。
圖 1 不同溶劑提取同一土壤樣品中飽和烴的HPLC-GC譜圖Fig. 1 HPLC-GC chromatograms of saturated hydrocarbons (SH) in the same soil sample extracted using different solvents Cycy: cyclohexylcyclohexane; Cho: 5α-cholestane.
2.1.2提取級數(shù)的優(yōu)化
為了考察提取是否完全,將土壤樣品按照2.1.1節(jié)的方法再重復(fù)提取一次,然后合并兩次提取液。結(jié)果發(fā)現(xiàn):提取兩次比提取一次的時(shí)間和溶劑消耗量均增加一倍,但飽和烴的含量僅增加了4.3%(見表1),說明經(jīng)過一次提取即可將絕大部分的石油烴提取出來。因此,確定提取級數(shù)為一次。
表 1 提取級數(shù)對同一土壤樣品中飽和烴(C10~C40)測定的影響
2.2.1凈化填料的選擇
提取石油烴時(shí),土壤中的腐殖酸、脂類、色素等極性干擾物也被一同提取出來[24],這些干擾物影響后續(xù)的分析,因此,需要對提取液進(jìn)行凈化。硅膠和硅酸鎂是常用的凈化填料[25],都能夠吸附動、植物油等極性干擾物質(zhì)。本研究采用食品中礦物油分析常用的活化硅膠作為凈化填料[26-30],并且考察和優(yōu)化了硅膠柱的凈化條件。
2.2.2洗脫溶劑的選擇
當(dāng)石油烴提取液進(jìn)入硅膠柱后,首先流出的是極性最低的飽和烴,隨后是極性稍高的芳香烴,最后是甘油三酯和環(huán)氧烯烴等極性更高一些的物質(zhì)。具體細(xì)分到飽和烴部分,由于體積排阻效應(yīng),首先流出的是大相對分子質(zhì)量的鏈烷烴、其次是低相對分子質(zhì)量的鏈烷烴和環(huán)烷烴;對于芳香烴部分,則首先流出的是高度烷基取代的單環(huán)芳烴,其次是高度烷基取代的多環(huán)芳烴、最后是低烷基取代或無烷基取代的芳香烴。為了嚴(yán)格控制石油烴的凈化以及飽和烴和芳香烴的分離情況,通常以多個(gè)化合物標(biāo)記組分的流出情況,即Cho標(biāo)記飽和烴的末端,TBB和Per分別標(biāo)記芳香烴的開端與末端。此外,標(biāo)準(zhǔn)溶液中通常還添加低沸點(diǎn)的n-C11和5B以分別考察飽和烴和芳香烴部分在整個(gè)前處理過程是否存在揮發(fā)損失;飽和烴部分的定量內(nèi)標(biāo)是Cycy(通常n-C13的濃度為Cycy的一半,用于考察Cycy的回收率),芳香烴部分的定量內(nèi)標(biāo)是2-MN或1-MN(兩種化合物的濃度相同)[18,31]。
由于HPLC硅膠色譜柱(250 mm×2.1 mm)只能吸附20 mg油脂[18],為了確保HPLC柱的分離性能,提取液在注入HPLC分離飽和烴和芳香烴之前需要預(yù)先采用SPE柱凈化。將1 mL飽和烴/芳香烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至SPE柱,待上樣液近干時(shí),分別用15 mL正己烷和正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)洗脫,每1 mL洗脫液收集1管,注入GC分析,考察洗脫溶劑能否將飽和烴和芳香烴完全洗脫。研究表明,僅用正己烷洗脫,直至最后1 mL芳香烴末端的標(biāo)記物Per仍未流出;而采用正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)洗脫,Per在第5管流出,11管結(jié)束(見圖2), 99%以上Per集中在5管到10管之間。為了充分回收芳香烴,本研究采用10 mL正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)混合溶劑作為洗脫液。
圖 2 飽和烴和芳香烴(AH)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過硅膠柱凈化后以正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)混合溶劑洗脫的結(jié)果Fig. 2 Elution order of mixed standard solution containing SH and aromatic hydrocarbons (AH) through the SPE column packed with silica gel and a solvent mixture of n-hexane and dichloromethane (8∶2, v/v)5B: pentylbenzene; MN: methylnaphthalene; TBB: tri-tert-butylbenzene; Per: perylene.
2.2.3HPLC-GC分析
將飽和烴/芳香烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述步驟凈化,所得洗脫液濃縮至約1 mL,注入HPLC-GC以1.3節(jié)條件分析。結(jié)果表明,n-C11、n-C13、Cycy和Cho只出現(xiàn)在飽和烴通道中,5B、1-MN、2-MN、TBB和Per只出現(xiàn)在芳香烴通道中;且n-C11和5B的回收率不低于90%, Cycy和n-C13的峰面積比例為2∶1, 1-MN和2-MN的峰面積比例為1∶1(見圖3)。說明SPE柱凈化性能和HPLC柱分離性能滿足同時(shí)測定土壤中飽和烴和芳香烴的需求。
圖 3 SH/AH混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)硅膠柱凈化后的HPLC-GC譜圖Fig. 3 HPLC-GC chromatograms of mixed standard solution of SH/AH purified by the SPE column packed with silica gel
2.3.1儀器性能考察
以1.3節(jié)條件分析n-C7~n-C40正構(gòu)烷烴混合溶液(見圖4),n-C10、n-C11…、n-C39、n-C40相對于n-C20的響應(yīng)因子在0.92~1.05之間,說明分析過程中低沸點(diǎn)目標(biāo)物沒有揮發(fā)損失,對高沸點(diǎn)目標(biāo)物沒有歧視,滿足分析要求(n-C10、n-C11、…、n-C39、n-C40相對于n-C20響應(yīng)因子應(yīng)高于0.80)[4]。
圖 4 n-C10~n-C40正構(gòu)烷烴混合溶液的HPLC-GC譜圖Fig. 4 HPLC-GC chromatogram of n-alkane (C10-C40) standards
2.3.2線性范圍考察
分別配制2.5、4、8、20、50、150、250、500 mg/L潤滑油(飽和烴與芳香烴的質(zhì)量比為85.5∶14.5)的正己烷溶液,取50 μL注入HPLC-GC測定。以潤滑油系列溶液濃度為橫坐標(biāo),分別以飽和烴和芳香烴駝峰的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:飽和烴在2.1~427.5 mg/L、芳香烴在2.9~72.5 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程分別為y=1 045.9x-1 532.3 (R2=0.999 7)和y=146.4x-772.3 (R2=0.999 3)。
2.3.3定量限
由于石油烴的GC-FID譜圖呈駝峰,根據(jù)儀器噪聲計(jì)算檢出限的方法GB5009.1-2003不適用于本方法。本方法定量限采用文獻(xiàn)方法計(jì)算,即進(jìn)入FID的石油烴總量至少達(dá)到100 ng才能準(zhǔn)確測定[18]。本方法稱取5 g土壤,經(jīng)提取、SPE柱凈化、濃縮等操作后得到體積為1 mL的供試液,最后取50 μL注入HPLC-GC定量分析,即相當(dāng)于有0.25 g樣品中的石油烴進(jìn)入FID檢測,因而對應(yīng)的LOQ值為0.4 mg/kg。
2.3.4準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證
稱取0.5 g SQC-116土壤石油烴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)7份,用上述方法測定,考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。測定平均值為2 809 mg/kg,與標(biāo)準(zhǔn)值相對誤差(RE)為10.6%,在證書提供的可信區(qū)間內(nèi);相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%,表明此方法分析測定土壤中的石油烴具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。
本實(shí)驗(yàn)采用上述方法,檢測了北京地區(qū)的5個(gè)土壤樣品中飽和烴和芳香烴含量,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,5個(gè)土壤樣品中均檢出飽和烴(C10~C40),其含量范圍為3.3~32.1 mg/kg;其中4個(gè)樣品中檢出芳香烴(C10~C40),其含量范圍為0.8~4.3 mg/kg,芳香烴的比例范圍為6.3%~13.2%。
表 2 土壤樣品中飽和烴和芳香烴(C10~C40)的含量
我們分析了兩個(gè)土壤樣品的譜圖(見圖5)。結(jié)果顯示:不同樣品的飽和烴與芳香烴呈現(xiàn)出不同的碳數(shù)范圍分布,其中No.1樣品中的飽和烴由兩個(gè)駝峰組成,低碳數(shù)范圍以n-C18為中心,含量為3.0 mg/kg,高碳數(shù)范圍以n-C29為中心,含量為3.6 mg/kg(圖5a-SH);此外,No.1樣品的芳香烴譜圖也顯示出與低碳數(shù)飽和烴(以n-C18為中心)對應(yīng)的駝峰,含量為0.6 mg/kg(圖5a-AH)。同樣,No.5土壤樣品也顯示出同樣碳數(shù)范圍的飽和烴和芳香烴駝峰(圖5b),只是含量不同。通常認(rèn)為低碳數(shù)范圍的烴類物質(zhì)主要來自柴油,而高碳數(shù)的烴類物質(zhì)駝峰是潤滑油的典型特征[32]。圖5的結(jié)果表明:土壤中的烴類物質(zhì)來源復(fù)雜,包含不同的碳數(shù)范圍,其中低碳數(shù)范圍含有芳香烴污染物。
本研究建立了高效液相色譜-氣相色譜聯(lián)用法同時(shí)測定土壤中飽和烴和芳香烴的方法,針對土壤樣品特性,優(yōu)化了提取和凈化兩個(gè)試樣制備環(huán)節(jié)。該方法整合了石油烴分析的凈化、分離與檢測步驟,靈敏度高、溶劑消耗少、準(zhǔn)確度及精密度良好,適合于土壤中可萃取性石油烴的測定。同時(shí),通過HPLC柱有效分離飽和烴和芳香烴,實(shí)現(xiàn)了毒性相對較高的芳香烴的測定,能更好地滿足石油烴污染物的監(jiān)測與評估需要。此外,通過譜圖分析還可以探索石油烴的污染來源,有助于進(jìn)一步提出相應(yīng)的預(yù)防處理措施。