郭金博， 華建峰， 殷云龍， 楊 穎，①

〔1. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省落羽杉屬樹木種質創(chuàng)新與繁育工程研究中心， 江蘇 南京 210014；2. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院， 江蘇 南京 210037〕

杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(TaxodiumRich.)植物為落葉或半常綠喬木，原產于北美及墨西哥。落羽杉屬共3種，分別為池杉(T.ascendensBrongn.)、落羽杉〔T.distichum(Linn.) Rich.〕和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)，均為二倍體植物，單倍體細胞染色體數為11(2n=22)[1]。江蘇省中國科學院植物研究所從1973年起開展落羽杉屬種間雜交試驗，已選育出10多個優(yōu)良無性系，定名為‘中山杉’(T.‘Zhongshanshan’)[2-7]。提高‘中山杉’的生長量是其育種工作的主要目標之一[8-9]，其生物量與葉片積累的光合作用產物密切相關，因此，提高葉片光合效率可獲得高光效速生‘中山杉’[10]。

植物葉片的葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均屬于微效多基因控制的數量性狀，遺傳規(guī)律復雜[11]。分子標記技術可快速、準確地改良植物的這些數量性狀，目前已應用于水稻(OryzasativaLinn.)[12]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[13]和玉米(ZeamaysLinn.)[14]等農作物的高光效育種研究，但在林木高光效育種研究中卻應用較少[15]。迄今為止，‘中山杉’育種仍以傳統雜交方式為主，育種周期較長，獲得的具優(yōu)良性狀的雜交后代較少，因此，將分子標記技術應用于‘中山杉’育種工作十分必要。

SNP標記為第3代分子標記，具有分布豐度高、穩(wěn)定性高、全自動化操作等優(yōu)勢，為高密度遺傳圖譜構建的理想工具[16]。然而，SNP標記的傳統開發(fā)過程耗時費錢，獲得的標記數量偏少[17]。雖然二代測序技術的發(fā)展使得在全基因組范圍內查找SNP分子標記成為可能[18]，但多數林木的全基因組測序成本較高，為此，人們開發(fā)了簡化基因組測序技術(SLAF)。該方法先用限制性內切酶降低基因組復雜程度，再用二代測序技術對酶切位點附近片段進行測序，大大地降低了SNP標記開發(fā)和基因分型的成本。

Yang等[19]利用SLAF測序技術在落羽杉屬植物指紋圖譜的基礎上構建了一張更高密度的遺傳圖譜，該圖譜平均圖距0.18 cM，包含11條連鎖群10 710個SNP標記，是目前落羽杉屬植物密度最高的遺傳圖譜。本研究以‘中山杉302’(T.‘Zhongshanshan 302’)×墨西哥落羽杉回交子代BC1群體為研究對象，對現存的111株植株葉片的光合性狀(包括凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率)和葉綠素含量(包括葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量)進行統計和相關性分析，并利用本課題組前期構建的落羽杉屬高密度遺傳圖譜[19]對這7個目標性狀進行QTL定位，以期找到調控落羽杉屬植物相關光合性狀和葉綠素含量的主效基因，闡明這些性狀的分子遺傳機制，為開展高光效落羽杉屬植物分子輔助育種研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

以栽種在江蘇省鎮(zhèn)江市丹陽市233國道與312國道交叉口(地理坐標為東經119°34′、北緯31°55′)的‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代BC1群體[19]為研究對象，現存植株共111株?！猩缴?02’為1988年江蘇省中國科學院植物研究所在落羽杉(母本)和墨西哥落羽杉(父本)的種間雜交子代(F1)中篩選出的優(yōu)良無性系。

1.2 方法

1.2.1 光合性狀測定 于2017年7月26日(天氣晴朗)的8：00—11：00及13：00—16：00，以及7月27日(天氣晴朗)的8：00—11：00及13：00—14：40，使用LI-6400便攜式光合測定儀(美國LI-COR公司)測定所有植株距地面約1.5 m處的健康葉片的光合性狀，測定指標包括凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率。每株選取3枚不同方向的葉片，每枚葉片重復檢測3次，結果取平均值。測定時，以紅藍光為光源，光照強度為1 200 μmol·m-2·s-1，葉室CO2濃度為380 μmol·mol-1。

1.2.2 葉面積測定 由于葉室內的葉片不能占滿整個葉室，因此，待光合性狀測定完畢后，需要準確測量被測葉片的面積，再根據被測葉片面積與葉室面積的比值以及各光合性狀指標的測定值計算各指標的實際值。測定時，將小葉摘下，重新擺放，使葉片完全展開且互不遮擋，用Epson Perfection V700掃描儀(日本Epson公司)掃描，并用WinRHIZO 軟件計算被測葉片面積。

1.2.3 葉綠素含量測定 將掃描后葉片清洗干凈、晾干并剪碎；稱取3份碎葉，每份0.2 g；加入體積分數95%乙醇25 mL，避光浸提24 h。以體積分數95%乙醇為空白對照，在波長665、649和470 nm下分別測定提取液的吸光度。根據測定結果計算葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量[20]。

1.3 數據處理

采用R/QTL V3.1.1軟件的復合區(qū)間作圖法對各性狀進行QTL分析，通過PT檢驗1 000次設定閾值，首先考慮0.99置信度對應的似然函數比值對數值(logarithm of odds，LOD)閾值，若沒有定位區(qū)間則考慮0.95和0.90置信度對應的LOD閾值。參照楊柳等[21]的標準，將LOD值大于2.0作為判定主效QTL存在的閾值，并將同一連鎖群上重疊的或遺傳距離小于5 cM的QTL歸為一個基因座。同時，統計各主效QTL的加性效應值(additive effect value，ADD)和解釋表型變異率(rate of explaining phenotypic variation，EXP)。

利用EXCEL 2007軟件記錄各指標的原始數據并計算各指標的最大值、最小值、平均值、標準差和變異系數；利用SPSS 19.0軟件對各指標數據進行正態(tài)分布分析。

2 結果和分析

2.1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量統計分析

從供試‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的頻率分布圖(圖1)看，供試7個性狀的頻率均呈現明顯的正態(tài)分布。

圖1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的頻率分布

供試植株葉片光合性狀和葉綠素含量的統計結果(表1)表明：供試植株的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率的變幅分別為0.50～7.98 μmol·m-2·s-1、0.06～0.52 mmol·m-2·s-1、150.60～216.01 μmol·mol-1和1.62～10.92 mmol·m-2·s-1，均值分別為3.91 μmol·m-2·s-1、0.23 mmol·m-2·s-1、190.94 μmol·mol-1和5.17 mmol·m-2·s-1。4個光合性狀中，胞間CO2濃度的變異系數最小，為7.39%，而凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率的變異系數則較大，均高于30%。其中，氣孔導度的變異系數為43.48%，凈光合速率的變異系數為40.15%，蒸騰速率的變異系數為33.27%。

表1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的統計

由表1還可見：葉綠素a含量、葉綠素b含量和總葉綠素含量的變幅分別為0.16～0.83、0.03～0.29和0.19～1.12 mg·g-1，均值分別為0.48、0.16和0.64 mg·g-1。3個指標中，葉綠素b含量的變異系數最大(37.50%)，葉綠素a含量和總葉綠素含量的變異系數也較大，分別為25.00%和26.56%。

2.2 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的QTL定位分析

QTL定位結果表明：‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片的蒸騰速率和葉綠素b含量未定位到QTL，而凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、葉綠素a含量和總葉綠素含量均定位到主效QTL，且葉綠素a含量和總葉綠素含量的似然函數比值對數值(LOD)和加性效應值(ADD)輪廓圖相似(圖2)。

LOD： 似然函數比值對數值Logarithm of odds； ADD： 加性效應值Additive effect value.

LOD值大于2.0的主效QTLs共8個，詳細特征見表2。由表2可見：這8個主效QTLs分別位于1號連鎖群(LG1)、6號連鎖群(LG6)和11號連鎖群(LG11)，其中，LG1和LG6各有2個主效QTLs，LG11有4個主效QTLs，共包含98個SLAF標記。并且，這些主效QTLs的置信區(qū)間不同。

表2 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的主效QTLs特征

由表2還可見：凈光合速率僅定位到1個主效QTL(q1-1)，位于LG1，q1-1包含25個SLAF標記，解釋表型變異率為5.68%，LOD值為2.08，ADD值為-0.78，說明該QTL區(qū)間基因參與凈光合速率負調控。氣孔導度也只定位到1個主效QTL(q11-1)，位于LG11，q11-1包含3個SLAF標記，解釋表型變異率為7.85%，LOD值為2.29，ADD值為-0.05，說明該QTL區(qū)間基因參與氣孔導度負調控。胞間CO2濃度定位到2個主效QTLs，均位于LG6，分別為q6-1和q6-2。其中，q6-1包含3個SLAF標記，解釋表型變異率為9.76%～10.70%，LOD值為3.83～4.65，ADD值為-8.67～-8.19，說明該QTL區(qū)間基因參與胞間CO2濃度負調控；q6-2只包含1個SLAF標記，解釋表型變異率為0.62%，LOD值為2.65，ADD值為2.08，說明該QTL區(qū)間基因參與胞間CO2濃度正調控。

由表2還可見：葉綠素a含量僅定位到1個主效QTL(q11-2)，位于LG1，q11-2包含13個SLAF標記，解釋表型變異率為10.95%，LOD值為2.94，ADD值為-0.08，說明該QTL區(qū)間基因參與葉綠素a含量負調控?？側~綠素含量在LG1上定位到1個主效QTL(q1-2)，在LG11上定位到2個主效QTLs，分別為q11-3和q11-4。其中，q1-2包含26個SLAF標記，解釋表型變異率為6.51%～6.64%，LOD值為2.27～2.40，ADD值為-0.09，說明該QTL區(qū)間基因參與總葉綠素含量負調控；q11-3包含26個SLAF標記，解釋表型變異率為9.66%，LOD值為3.01，ADD值為-0.10，說明該QTL區(qū)間基因參與總葉綠素含量負調控；q11-4僅包含1個SLAF標記，解釋表型變異率為6.60%，LOD值為2.13，ADD值為-0.09，說明該QTL區(qū)間基因參與總葉綠素含量負調控。

3 討 論

相關研究結果表明：從基因組差異較大的親本雜交后代中能獲得更多的多態(tài)性標記[22]。但是，當雙親基因組差異較大時，其染色體的非同源區(qū)段也可能增多，致使連鎖分析難度增大[23]；同時，雙親基因組差異較大還會造成染色體結構不穩(wěn)定，致使同源染色體在配對時更易發(fā)生交叉互換[24]，嚴重破壞標記和性狀間的穩(wěn)定性。本研究從‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代中共定位到8個主效QTLs，LOD值為2.08～4.65，解釋表型變異率為0.62%～10.95%，上述原因可能是導致獲得的主效QTLs較少、LOD值偏低及解釋表型貢獻率較低的主要原因。

本研究定位到的8個主效QTLs分別位于LG1、LG6和LG11連鎖群上，其中，LG1和LG6各有2個主效QTLs，LG11有4個主效QTLs，且各主效QTLs的置信區(qū)間不同，說明這8個主效QTLs不存在“一因多效”現象。值得注意的是，僅q6-2位點基因參與胞間CO2濃度正調控，其余7個主效QTLs區(qū)間基因均參與相應性狀的負調控。植物光合作用是一系列復雜的代謝反應的總和，極易受環(huán)境因子的影響[25-26]。本研究實驗期間正處于當地最熱階段，供試植株在高溫條件下會閉合氣孔以減少水分蒸發(fā)，必然導致光合作用下降，這可能是本研究定位到的主效QTL區(qū)間基因主要參與光合性狀負調控的重要原因。另外，供試植株在7月份已度過快速生長期，此時參與光合性狀負調控的基因可能較參與光合性狀正調控的基因更多、更活躍。

本研究獲得的8個主效QTLs主要參與光合性狀和葉綠素含量負調控，結合相關研究結果[19]，認為這些主效QTLs與‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代的相關生長性狀呈不同程度負相關，在速生和高光效‘中山杉’育種工作中，可選擇沉默或敲除這些主效QTL區(qū)間基因的方式達到育種目標。此外，調控‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代生根性狀的q11-1(標記區(qū)間為7 574～55 445)[27]與本研究獲得的調控總葉綠素含量的q11-3(標記區(qū)間為7 685～104 488)部分重合，且完全位于本研究獲得的調控葉綠素a含量的q11-2(標記區(qū)間為3 256～77 731)內，說明‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代的光合、生長和生根性狀間存在密切關系。