劉震 徐玉鵬 王秀領(lǐng) 黃素芳 趙忠祥 閻旭東

摘要：為明確黑龍港地區(qū)苜蓿土壤微生物多樣性，利用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)多年生苜蓿土壤及對(duì)照土壤微生物真菌ITS區(qū)進(jìn)行測(cè)定，并分析了不同處理間土壤微生物群落特點(diǎn)。結(jié)果表明，對(duì)照處理獲得真菌OTUs 523個(gè)，四年生苜蓿處理OTUs 742個(gè)。物種分類顯示對(duì)照處理隸屬12門22綱56目107科146屬，四年生苜蓿處理隸屬10門28綱60目126科186屬。各處理水平下均以子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢(shì)真菌種群，其相對(duì)豐度分別為54.69%和61.81%。苜蓿多年建植后可以增加土壤中腐生菌類數(shù)量，加快腐殖化進(jìn)程，有利于提高土壤肥力及有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)也可以降低擔(dān)子菌門等致病菌的相對(duì)豐度，對(duì)減少植物土傳病害起到積極作用。

關(guān)鍵詞：黑龍港;苜蓿;土壤微生物;真菌;群落結(jié)構(gòu);多樣性分析

中圖分類號(hào)：S154.3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0197-04

苜蓿是我國(guó)北方重要的飼料作物，擁有高蛋白、生物固氮能力強(qiáng)及適應(yīng)能力強(qiáng)等特性，近年來(lái)已成為北方調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的重要產(chǎn)業(yè)[1]。同時(shí)，常年種植苜?？梢燥@著改善土壤物理結(jié)構(gòu)，Eynard等研究表明，同耕地土壤相比，草地土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性約高17%[2]。 Barber通過(guò)多年試驗(yàn)得出結(jié)論，長(zhǎng)期種植苜蓿可提高土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體指數(shù)，該指數(shù)同苜蓿種植年限呈正相關(guān)關(guān)系[3]。不僅如此，種植苜蓿還會(huì)影響土壤養(yǎng)分組成，羅珠珠等研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿生長(zhǎng)達(dá)一定年限后，可以顯著提高土壤表層輕組有機(jī)碳[4];黃祥豐等研究表明，種植苜蓿可以提高0～60 cm各土層有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮含量[5]。然而，關(guān)于苜蓿對(duì)土壤的影響主要集中于土壤養(yǎng)分時(shí)間及空間變化，對(duì)土壤微生物研究較少，吳建峰研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物可以促進(jìn)植物根系吸收養(yǎng)分[6]，同時(shí)土壤微生物也是土壤生態(tài)功能的重要指示物[7]。因此，研究微生物組成及其特性有重要意義。

高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)基因序列對(duì)土壤微生物進(jìn)行分析，在分析微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)有巨大優(yōu)勢(shì)，能更好地揭示土壤中微生物群落及構(gòu)成[8]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序方法對(duì)滄州市農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地土壤中的真菌群落構(gòu)成及豐度進(jìn)行了分析，為苜蓿改良土壤生態(tài)環(huán)境、提高土壤肥力提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年7月15日在河北省滄州市獻(xiàn)縣北張白村滄州市農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地（116.36E，38.31N）選擇四年生苜蓿根際土壤（Y4）作為研究對(duì)象，同時(shí)選取該研究對(duì)象周邊未耕作土壤作為對(duì)照（CK）。采用五點(diǎn)法取樣，每個(gè)處理按照梅花形確定5個(gè)采樣點(diǎn)。每個(gè)采樣點(diǎn)內(nèi)選取生長(zhǎng)良好的苜蓿樣品，去除其周邊及表層雜草后，采用抖落法取水平深度 0～20 cm苜蓿根際土壤約10 g為1個(gè)采樣點(diǎn)，待5個(gè)采樣點(diǎn)全部取完后充分混勻，采用四分法選取混合均勻的土壤樣品保存為1份土壤待測(cè)樣品。將待測(cè)樣品裝入無(wú)菌密封袋，放入裝有干冰的泡沫箱中保存。待全部樣品采集完成后運(yùn)輸回試驗(yàn)室，超低溫冰箱-80 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品DNA提取及測(cè)序 將土壤提取基因組后采用NanoDrop-ND1000分光光度儀測(cè)定總DNA濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA提取質(zhì)量。選擇質(zhì)量合格的DNA樣品進(jìn)行真菌ITS1區(qū)測(cè)序，測(cè)序工作由北京百邁客科技有限公司完成，使用Illumina-HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 DNA質(zhì)量評(píng)價(jià) 去除低質(zhì)量Reads，根據(jù)PE數(shù)據(jù)之間Overlap關(guān)系將成對(duì)的Reads拼接成一條序列。去除Tags兩端的Barcode序列及引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到高質(zhì)量的Clean Tags。然后對(duì)拼接好的序列進(jìn)行進(jìn)一步的去除嵌合體和段序列得到優(yōu)質(zhì)序列。

1.2.3 生物信息分析 使用QIIME 1.8.0[9]軟件中的 UCLUST[10]對(duì)Tags在97%相似度水平下獲得OTU，并基于真菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，統(tǒng)計(jì)各樣品OTU中的豐度信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列統(tǒng)計(jì)和微生物多樣性

經(jīng)提取后，四年生苜蓿土壤（Y4）DNA濃度為2.5 ng/μL，D260 nm/280 nm值為4.18，D260 nm/230 nm值為0.03，對(duì)照土壤（CK）DNA濃度為1.9 ng/μL，D260 nm/280 nm值為2.88，D260 nm/230 nm值為0.08。各處理土壤樣品符合PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步以行擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序，樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1，Tags長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照土壤真菌群落組成

通過(guò)對(duì)照土壤真菌OTUs分析結(jié)果可以看出，其真菌群落隸屬于12門22綱56目107科146屬。由圖2可見(jiàn)，在門水平分類上至少隸屬于12個(gè)不同的真菌門，其中，相對(duì)豐度≥2%的有子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、真菌門，其相對(duì)豐度分別為54.69%、5.03%、10.65%、2.27%;另外還有未能分類的真菌和未知真菌，其相對(duì)豐度分別為24.69%和2.69%。

在綱水平上至少隸屬于22個(gè)綱，相對(duì)豐度≥1%的有12個(gè)，其名稱分別為糞殼菌綱（30.57%）、座囊菌綱（12.84%）、散囊菌綱（8.09%）、酵母菌（2.16%）、錘舌菌綱（1.03%）、新囊菌綱（2.27%）、孢霉綱（3.20%）、毛霉綱（1.83%）、傘菌綱（9.36%）、節(jié)擔(dān)菌綱（1.29%）、未分類真菌（24.69%）和未知真菌（2.69%）。

在目分類水平上隸屬于56目，相對(duì)豐度≥1%的有12個(gè)，分別是肉座菌目（18.23%）、散囊菌目（7.13%）、糞殼菌目（5.85%）、格孢腔菌目（6.05%）、煤炱目（4.36%）、牛肝菌目（3.37%）、被孢霉目（3.20%）、新麗鞭毛菌目（2.27%）、球團(tuán)目（2.11%）、毛霉目（1.83%）、未分類真菌（27.18%）、未知真菌（18.43%）。

2.3 四年生苜蓿處理土壤真菌生物多樣性

通過(guò)對(duì)四年生苜蓿土壤真菌OTUs分析結(jié)果可以看出，其真菌群落隸屬于10門28綱60目126科186屬。由圖3可見(jiàn)，在門水平分類上至少隸屬于10個(gè)不同的真菌門，其中，相對(duì)豐度≥3%的有子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、真菌門，其相對(duì)豐度分別為61.81%、5.64%、8.84%、3.13%;另外還有未能分類的真菌和未知真菌，其相對(duì)豐度分別為24.69%和2.69%。

在綱水平上至少隸屬于28個(gè)綱，其中，相對(duì)豐度≥1%的有12個(gè)，其名稱分別為糞殼菌綱（37.59%）、座囊菌綱（11.11%）、散囊菌綱（9.73%）、酵母菌（2.03%）、錘舌菌綱（1.35%）、新囊菌綱（3.13%）、孢霉綱（3.20%）、毛霉綱（2.44%）、傘菌綱（7.32%）、節(jié)擔(dān)菌綱（1.52%）、未分類真菌（17.58%）和未知真菌（3.01%）。

在目分類水平上隸屬于60目，其中，相對(duì)豐度≥1% 的有12個(gè)，其名稱分別是肉座菌目（22.23%）、散囊菌目（8.99%）、糞殼菌目（8.08%）、格孢腔菌目（5.05%）、煤炱目（4.47%）、牛肝菌目（4.08%）、被孢霉目（3.20%）、新麗鞭毛菌目（3.13%）、球團(tuán)目（2.27%）、毛霉目（2.44%）、未分類真菌（20.73%）、未知真菌（15.35%）。

2.4 Alpha和Beta多樣性分析

Alpha多樣性（表2）分析可以看出，Y4處理OUT數(shù)量為710，較CK處理OUT數(shù)量提高19.13%，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)也分別提高了19.21%和18.78%，說(shuō)明Y4土壤中真菌微生物種類及豐度均大于CK土壤。Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明樣品中物種多樣性越高，結(jié)合Simpson和Shannon指數(shù)可以看出，Y4土壤中真菌的種類也高于CK土壤，結(jié)果同OUT等指數(shù)得出的結(jié)論相似。

而由圖4可見(jiàn)，PCA分析可以代表89.70%的主要信息，其中可以明顯看出CK與Y4處理距離較遠(yuǎn)，差異性較大;而通過(guò)Beta多樣性組間差異分析也可以直觀反映出CK與Y4處理組間差異較大，且達(dá)到極顯著水平。

3 結(jié)論與討論

土壤中含有大量組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物群落[8]，這些群落在地球化學(xué)循環(huán)中起重要的作用[11-13]， 不僅影響土壤有機(jī)質(zhì)分解、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化

及運(yùn)移，同時(shí)在土壤腐殖質(zhì)形成、各類土壤污染物的分解以及植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收過(guò)程中也發(fā)揮一定的功能。通常可以用土壤微生物群落構(gòu)成來(lái)反映土壤微生物多樣性，也在一定程度上體現(xiàn)了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[14]。一般來(lái)說(shuō)，微生物群落組成的復(fù)雜程度與土壤抵御不良生態(tài)環(huán)境的能力成正比。本試驗(yàn)對(duì)多年生苜蓿土壤及對(duì)照土壤中真菌群落組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)常年種植苜蓿在門水平真菌分類相對(duì)明確，但在綱水平及目水平下，仍有較大比例真菌不能準(zhǔn)確分類。

測(cè)序結(jié)果表明，對(duì)照及四年生苜蓿土壤中均檢測(cè)到子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和真菌門，群落組成相對(duì)簡(jiǎn)單。子囊菌門為土壤中的優(yōu)勢(shì)群落，對(duì)照和四年生苜蓿處理子囊菌門相對(duì)豐度分別為54.69%和61.81%，四年生苜蓿的提高7.12百分點(diǎn);結(jié)核菌門、真菌門及未知真菌無(wú)明顯變化;擔(dān)子菌門相對(duì)豐度分別為10.65%和8.84%，四年生苜蓿的下降了1.81百分點(diǎn)。同對(duì)照相比，四年生苜蓿中有部分未分類真菌被檢測(cè)出，導(dǎo)致該處理中未分類真菌相對(duì)豐度下降了7.11百分點(diǎn)。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，鹽堿條件并不是子囊菌門真菌生存的限制因素，子囊菌門真菌群落可以在鹽堿條件下生存，甚至進(jìn)一步擴(kuò)大群落[15-16]，該結(jié)果同李巖等的研究結(jié)果[17-18]相似。子囊菌門為土壤中優(yōu)勢(shì)真菌群落，其群落主要由腐生菌構(gòu)成。腐生菌可以通過(guò)分泌多種酶以體外方式分解土壤中的有機(jī)質(zhì)及動(dòng)植物尸體，形成二氧化碳、無(wú)機(jī)鹽和簡(jiǎn)單的有機(jī)物，為農(nóng)田土壤中的植物提供養(yǎng)分，是土壤養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中的重要真菌，說(shuō)明在黑龍港鹽堿地區(qū)種植苜?？梢蕴岣咦幽揖T真菌群落相對(duì)豐度，進(jìn)一步改善土壤養(yǎng)分環(huán)境。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)土壤中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度降低，擔(dān)子菌門中一些微生物可以引起作物黑穗病、銹病以及一些其他森林和植物的病害，該門類真菌相對(duì)豐度的降低對(duì)減少作物病害也起到了一定積極的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在多年生苜蓿土壤中肉座菌目及糞殼科目菌類相對(duì)豐度有顯著提高，分別提高了4.00百分點(diǎn)和2.23百分點(diǎn)，這2類真菌的主要作用是降解腐爛有機(jī)質(zhì)及纖維素[19]。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了長(zhǎng)期種植苜蓿土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及結(jié)構(gòu)性，發(fā)現(xiàn)多年種植苜蓿后，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，腐殖真菌群落相對(duì)豐度提高，腐殖化進(jìn)程加快，可利于提高土壤肥力及有機(jī)質(zhì)。但是由于根際土壤微生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，受土壤物理結(jié)構(gòu)、施肥方式等影響較大，不同作物根系分泌物對(duì)微生物影響也不盡相同[20-24]。因此，苜蓿種植對(duì)土壤微生物真菌影響的主要因素和機(jī)制尚未完全明了，還需開展進(jìn)一步研究。

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