高 晶，馬 力，陳隆升，李志鋼，陳永忠

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.省部共建木本油料資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

油茶籽經(jīng)物理壓榨或浸出提取后的副產(chǎn)品稱為油茶粕，我國(guó)平均年產(chǎn)量大概為40～80萬(wàn)t，約為茶油年產(chǎn)量的3倍[1]。茶皂素是指存在于油茶粕中的一種天然糖苷化合物。茶皂素溶于水時(shí)，表現(xiàn)出生物活性和表面活性，具有較強(qiáng)的殺菌抑菌作用[2- 3]。此外，茶皂素可與血紅細(xì)胞細(xì)胞壁組成物質(zhì)膽固醇相結(jié)合，形成水溶性分子復(fù)合物，造成血紅細(xì)胞滲透壓增大而破裂的溶血現(xiàn)象[4- 5]。但這種毒性對(duì)人體無(wú)害，而特異性作用于冷血?jiǎng)游?，尤其是魚(yú)類(lèi)。魚(yú)藤酮來(lái)自豆科藤本植物——魚(yú)藤的根部，具有殺蟲(chóng)活性，對(duì)大約800多種害蟲(chóng)均具有殺蟲(chóng)效果。魚(yú)藤進(jìn)入害蟲(chóng)體內(nèi)后，對(duì)害蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育起抑制作用，同時(shí)減弱其呼吸作用而使害蟲(chóng)能量供應(yīng)不足最終死亡。此外，據(jù)研究，魚(yú)藤酮對(duì)人畜無(wú)害且對(duì)環(huán)境無(wú)污染，是一種環(huán)保的殺蟲(chóng)劑。三氯異氰脲酸和溴氰菊酯都具有較強(qiáng)的殺菌抑菌能力，不僅對(duì)環(huán)境和人體安全，而且無(wú)致畸和致癌作用。

我國(guó)蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)從1978年萌芽開(kāi)始就經(jīng)歷飛速發(fā)展。 到2019年，中國(guó)對(duì)蝦單位面積產(chǎn)量達(dá)2.08 t·hm-2。據(jù)2020年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒統(tǒng)計(jì)，我國(guó)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量已占世界對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%以上[6]。然而，在對(duì)蝦蟹的養(yǎng)殖中常常會(huì)遭遇養(yǎng)殖池中固有的魚(yú)類(lèi)以及野生雜魚(yú)的威脅，造成飼料競(jìng)爭(zhēng)，甚至威脅幼蝦蟹苗和處于蛻殼生長(zhǎng)期的對(duì)蝦，從而嚴(yán)重影響蝦蟹的產(chǎn)量，對(duì)蝦蟹養(yǎng)殖者造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[7- 8]。目前,我國(guó)蝦蟹養(yǎng)殖還主要依靠石灰等化學(xué)試劑作為清塘劑，大多數(shù)存在毒殺無(wú)選擇性、成本高和不安全等缺點(diǎn)[9]。因此，開(kāi)發(fā)一種低毒、高效、低殘留且對(duì)環(huán)境友好的對(duì)蝦蟹養(yǎng)殖清塘劑具有較好的應(yīng)用前景。茶皂素屬于三萜類(lèi)皂角甙，可從油茶粕中提取獲得[10]。油茶粕茶皂素對(duì)魚(yú)類(lèi)紅細(xì)胞具有溶血作用，可以通過(guò)破壞魚(yú)鰓的上皮細(xì)胞而進(jìn)入魚(yú)鰓的血管，使細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外滲與血紅細(xì)胞解體[11- 12]。而茶皂素對(duì)蝦蟹無(wú)毒性且可促進(jìn)蝦的脫殼和生長(zhǎng)。此外，茶皂素可通過(guò)自然分解或者微生物迅速降解，是一種理想的環(huán)境友好型清塘劑[13]。本文旨在以油茶粕為主要原料，精提主要活性成分茶皂素，尋求高效、高安全性、低成本的新型清塘劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)涉及的雄魚(yú)、鯽魚(yú)、草魚(yú)、基圍蝦、中國(guó)對(duì)蝦均從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得。雄魚(yú)體長(zhǎng)10～25 cm，鯽魚(yú)體長(zhǎng)10～15 cm，草魚(yú)體長(zhǎng)10～25 cm，基圍蝦體長(zhǎng)3～6 cm，中國(guó)對(duì)蝦體長(zhǎng)2～5 cm。試驗(yàn)魚(yú)在曝氣的自來(lái)水中預(yù)飼2 d。試驗(yàn)魚(yú)用水族箱大小120 cm×60 cm×60 cm，試驗(yàn)水深40 cm左右；試驗(yàn)蝦用水族箱大小90 cm×50 cm×50 cm，試驗(yàn)水深30 cm左右。試驗(yàn)水溫為26 ℃，試驗(yàn)用pH值在6.0～7.0之間。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)在國(guó)家林業(yè)局油茶研究開(kāi)發(fā)中心(于2008年經(jīng)國(guó)家林業(yè)局批準(zhǔn)，依托湖南省林業(yè)科學(xué)院而成立的專(zhuān)門(mén)從事油茶產(chǎn)業(yè)研究與成果轉(zhuǎn)化的平臺(tái))內(nèi)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 茶皂素復(fù)合清塘劑的制備 首先，稱取55～75 g茶粕用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)篩網(wǎng)，加入100 ml水?dāng)嚢?，混合均勻并過(guò)濾。然后，加入15～25 g魚(yú)藤酮，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻并過(guò)濾；加入4～10 g三氯異氰脲酸，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻并過(guò)濾；再加入8～15g溴氰菊酯，用渦旋混勻儀(保鮮膜包裹)混合均勻。所得溶液攪拌后抽濾濃縮得到濃縮液，通過(guò)噴霧干燥得到清塘劑試驗(yàn)品。

1.3.2 茶皂素復(fù)合清塘劑對(duì)常見(jiàn)淡水魚(yú)的毒殺計(jì)量關(guān)系的研究試驗(yàn) 制備茶皂素55%～70%、魚(yú)藤酮15%～25%、三氯異氰脲酸4%～10%、溴氰菊酯8%～15%的復(fù)合清塘劑4種(見(jiàn)表1)。每只水族箱放養(yǎng)鯽魚(yú)(A1組)、雄魚(yú)(B1組)和草魚(yú)(C1組)各20條，分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度(參考已有報(bào)道和本試驗(yàn)所用清塘劑成分)加入復(fù)合清塘劑1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組1(cont1 — 1組)，不加任何藥物；另外設(shè)置其他品牌清塘劑作為對(duì)照組2(cont 2 — A1，其他品牌清塘劑鯽魚(yú)對(duì)照組/ cont 2 — B1，其他品牌清塘劑雄魚(yú)對(duì)照組/ cont 2 — C1，其他品牌清塘劑草魚(yú)對(duì)照組)。試驗(yàn)時(shí)采用氧氣泵充氧，進(jìn)行48小時(shí)觀察記錄，試驗(yàn)重復(fù)2次。

表1 各茶皂素復(fù)合清塘劑成分及其含量百分比Tab.1 Percentage of tea saponin-pond clearing agents com-position and content of tea saponin%茶皂素魚(yú)藤酮三氯異氰脲酸溴氰菊酯復(fù)合清塘劑155251010復(fù)合清塘劑26020812復(fù)合清塘劑36518611復(fù)合清塘劑47016410

復(fù)合清塘劑2-4試驗(yàn)設(shè)計(jì)與復(fù)合清塘劑1一致。復(fù)合清塘劑3試驗(yàn)過(guò)程分組如下：鯽魚(yú)(A3組)、雄魚(yú)(B3組)和草魚(yú)(C3組)，空白對(duì)照組1(cont 1 — 3組)、其他品牌清塘劑作為對(duì)照組2(cont 2 — A3，其他品牌清塘劑鯽魚(yú)對(duì)照組/ cont 2 — B3，其他品牌清塘劑雄魚(yú)對(duì)照組/ cont 2 — C3，其他品牌清塘劑草魚(yú)對(duì)照組)。

1.3.3 茶皂素復(fù)合清塘劑對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺計(jì)量關(guān)系的研究試驗(yàn) 蝦鰓與魚(yú)鰓的結(jié)構(gòu)和成分完全不同，蝦鰓的主要成分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)。較低濃度茶皂素對(duì)蝦幾乎不產(chǎn)生毒副作用。因此，本試驗(yàn)選擇較大劑量復(fù)合茶皂素清塘劑來(lái)驗(yàn)證對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺效能。每只水族箱放養(yǎng)基圍蝦(D組)和中國(guó)對(duì)蝦(E組)各30尾，分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對(duì)濃度加入復(fù)合清塘劑1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組3(cont 3 — 1組)，不加任何藥物；另外設(shè)置其他品牌清塘劑作為對(duì)照組4(cont 4 — D1，其他品牌清塘劑基圍蝦對(duì)照組/ cont 4 — E1，其他品牌清塘劑中國(guó)對(duì)蝦對(duì)照組)。采用氧氣泵充氧，進(jìn)行48小時(shí)觀察記錄，試驗(yàn)重復(fù)2次。

復(fù)合清塘劑2 — 4試驗(yàn)設(shè)計(jì)與復(fù)合清塘劑1一致。復(fù)合清塘劑3試驗(yàn)過(guò)程分組如下：基圍蝦(D3組)和中國(guó)對(duì)蝦(E3組)、空白對(duì)照組3(cont 3 — 3組)、其他品牌清塘劑作為對(duì)照組4(cont 4 — D3，其他品牌清塘劑基圍蝦對(duì)照組/ cont 4 — E3，其他品牌清塘劑中國(guó)對(duì)蝦對(duì)照組)。

2 結(jié)果與分析

2.1 相同濃度茶皂素復(fù)合清塘劑毒殺效能的研究

2.1.1 相同濃度復(fù)合清塘劑1毒殺效能的研究

(1)對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究。分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑1處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)，研究不同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能(見(jiàn)圖1 A-D)。根據(jù)結(jié)果可知：相同濃度的復(fù)合清塘劑1對(duì)各試驗(yàn)用魚(yú)的毒殺能力與試驗(yàn)時(shí)間成正比；當(dāng)復(fù)合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時(shí)，各類(lèi)魚(yú)存活率依次是鯽魚(yú)<草魚(yú)<雄魚(yú)；與其他品牌清塘劑相比，復(fù)合清塘劑1對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能更高。

圖1 相同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能Fig.1 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦毒殺效能的研究。分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑1處理基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦，研究不同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺效能(見(jiàn)圖2 A-D)。根據(jù)結(jié)果可知：跟其他品牌清塘劑相比，復(fù)合清塘劑1對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦幾乎無(wú)毒殺能力；復(fù)合清塘劑1對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺能力隨著時(shí)間的推移并沒(méi)有增強(qiáng)。

圖2 相同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)蝦的毒殺效能Fig.2 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.2 相同濃度復(fù)合清塘劑2毒殺效能的研究

(1)對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究。按照1.3所示試驗(yàn)方法制備復(fù)合清塘劑2，同樣以 1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)，結(jié)果顯示復(fù)合清塘劑2對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能與復(fù)合清塘劑1結(jié)果類(lèi)似。

(2)對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦毒殺效能的研究。制得復(fù)合清塘劑2，選擇10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對(duì)濃度處理基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦，結(jié)果顯示復(fù)合清塘劑2對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺效能與復(fù)合清塘劑1結(jié)果類(lèi)似。

2.1.3 相同濃度復(fù)合清塘劑3毒殺效能的研究

(1)對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究

分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑3處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)，研究不同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能(見(jiàn)圖3 A-D)。根據(jù)結(jié)果可知：相同濃度的復(fù)合清塘劑3對(duì)各試驗(yàn)用魚(yú)的毒殺能力與試驗(yàn)時(shí)間成正比；與其他品牌清塘劑和復(fù)合清塘劑3相比，復(fù)合清塘劑3對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能更強(qiáng)；當(dāng)復(fù)合清塘劑3的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時(shí)，各類(lèi)魚(yú)存活率依次是鯽魚(yú)<草魚(yú)<雄魚(yú)。

圖3 相同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能Fig.3 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦毒殺效能的研究。分別以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑3處理基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦，研究不同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺效能(見(jiàn)圖4 A-D)。根據(jù)結(jié)果可知：跟其他品牌清塘劑相比，復(fù)合清塘劑3對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦幾乎無(wú)毒殺能力；復(fù)合清塘劑3對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺能力隨著時(shí)間的推移并沒(méi)有增強(qiáng)。

圖4 相同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)蝦的毒殺效能Fig.4 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.4 相同濃度復(fù)合清塘劑4毒殺效能的研究

(1)對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究。同樣的試驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)研究復(fù)合清塘劑4對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能，結(jié)果顯示復(fù)合清塘劑4對(duì)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能與復(fù)合清塘劑3結(jié)果類(lèi)似。

(2)對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦毒殺效能的研究。復(fù)合清塘劑4對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦的毒殺效能與復(fù)合清塘劑3結(jié)果類(lèi)似。

2.2 不同濃度茶皂素復(fù)合清塘劑對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究

2.2.1 不同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究 分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑1處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)，研究不同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)鯽魚(yú)草魚(yú)和雄魚(yú)的毒殺效能(見(jiàn)圖5 A-C)。根據(jù)結(jié)果可知：不同濃度的復(fù)合清塘劑1對(duì)各試驗(yàn)用魚(yú)的毒殺能力隨著時(shí)間推移而增強(qiáng)；當(dāng)復(fù)合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時(shí)，1.5 mg·L-1復(fù)合清塘劑1在36 h對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能最強(qiáng)；當(dāng)復(fù)合清塘劑1的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時(shí)，2.0 mg·L-1復(fù)合清塘劑1在24 h時(shí)對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能最強(qiáng)。

圖5 不同濃度復(fù)合清塘劑1對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能Fig.5 The different concentration of the composite pond clearing agents 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.2 不同濃度復(fù)合清塘劑2對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究 不同濃度復(fù)合清塘劑2處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能與復(fù)合清塘劑1的毒殺效能類(lèi)似。

2.2.3 不同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究 分別以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1絕對(duì)濃度復(fù)合清塘劑3處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)，研究不同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)鯽魚(yú)草魚(yú)和雄魚(yú)的毒殺效能(見(jiàn)圖6 A-C)。根據(jù)結(jié)果可知：不同濃度的復(fù)合清塘劑3對(duì)各試驗(yàn)用魚(yú)的毒殺能力隨著時(shí)間推移而增強(qiáng)；不同濃度的復(fù)合清塘劑3對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺能力相似，當(dāng)復(fù)合清塘劑3的濃度在1.0～3.5 mg·L-1時(shí)，1.5 mg·L-1復(fù)合清塘劑3在36 h時(shí)對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能最強(qiáng)，2.0 mg·L-1復(fù)合清塘劑3在24小時(shí)對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能最強(qiáng)，3.5 mg·L-1復(fù)合清塘劑3在8 h對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能最強(qiáng)。

圖 6不同濃度復(fù)合清塘劑3對(duì)各類(lèi)魚(yú)的毒殺效能Fig.6 The different concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.4 不同濃度復(fù)合清塘劑4對(duì)魚(yú)類(lèi)毒殺效能的研究 結(jié)果顯示不同濃度復(fù)合清塘劑4處理鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)的毒殺效能與復(fù)合清塘劑3結(jié)果類(lèi)似。

2.3 各復(fù)合清塘劑對(duì)魚(yú)毒活性持續(xù)能力的研究

所有水族箱備水，投入1.5 mg·L-1復(fù)合清塘劑1，48 h后每只水族箱放養(yǎng)鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)各20條，基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦各30尾，觀察48 h。在試驗(yàn)持續(xù)的48 h內(nèi)，鯽魚(yú)、雄魚(yú)、草魚(yú)、基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦均無(wú)死亡，表明本研究所使用復(fù)合清塘劑在投入養(yǎng)殖塘48 h后清塘效能減弱或消失，對(duì)塘內(nèi)魚(yú)和蝦類(lèi)幾乎不具有毒性。

3 結(jié)論與討論

茶皂素對(duì)蝦蟹養(yǎng)殖中固有魚(yú)類(lèi)存在較強(qiáng)的魚(yú)毒活性。在生產(chǎn)實(shí)際中，當(dāng)清塘劑中茶皂素含量在55%～70%時(shí)，當(dāng)使用濃度達(dá)到1.5 mg·L-1時(shí)，36 h即可將養(yǎng)殖塘中鯽魚(yú)、雄魚(yú)和草魚(yú)等常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)清理干凈，并對(duì)基圍蝦和中國(guó)對(duì)蝦無(wú)毒性；當(dāng)使用濃度達(dá)到3.5 mg·L-1時(shí)，用藥8 h，試驗(yàn)用魚(yú)死亡率可達(dá)到100%。此外，蝦蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中，使用茶皂素復(fù)合清塘劑清塘48 h后，茶皂素復(fù)合清塘劑可在自然條件下降解，不影響后續(xù)的生產(chǎn)養(yǎng)殖[8，14]。

目前，國(guó)內(nèi)外蝦蟹養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)400萬(wàn)t以上，預(yù)計(jì)將會(huì)持續(xù)增長(zhǎng)，蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)仍是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有前景和活力的行業(yè)[15-16]。然而各類(lèi)固有魚(yú)和細(xì)菌等的存在阻礙了蝦蟹養(yǎng)殖的總產(chǎn)量和存活率，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。因此，尋求安全環(huán)保、持續(xù)性好的清塘劑產(chǎn)品十分關(guān)鍵。本文所述茶皂素復(fù)合清塘劑具有制備工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、操作性簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，具有高效、低殘留的特點(diǎn),適用于工業(yè)生產(chǎn)，可為現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)實(shí)際中固有魚(yú)類(lèi)的清除提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。