朱文怡 李生君 候倩倩

白血病是一種血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，老年白血病具有起病隱匿、初始癥狀不典型、伴有多種基礎(chǔ)疾病等特點(diǎn)。老年白血病病人臨床治療時(shí)，容易發(fā)生感染或出血，骨髓抑制期相對(duì)較長(zhǎng)，因此臨床死亡率較高[1]。KIR2DL4基因是殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因家族中的功能型結(jié)構(gòu)基因，其等位基因多態(tài)性水平豐富，且在老年白血病中的分布、檢出率存在差異[2]。而KIR2DL4基因發(fā)揮作用依賴于相應(yīng)配體的存在，KIR2DL4與非經(jīng)典HLA-G分子配位[3]。有研究表明，急性髓系白血病及慢性淋巴細(xì)胞白血病病人細(xì)胞異常表達(dá)HLA-G分子，且伴有促凋亡基因HtrA2水平升高，其表達(dá)水平能反映白血病病人疾病嚴(yán)重程度，可指導(dǎo)臨床治療[4]。既往研究表明，白血病病人伴有促凋亡基因HtrA2表達(dá)水平異常，能加劇病情的發(fā)展[5]，但是二者具體關(guān)系尚未闡明。本研究探討KIR2DL4基因多態(tài)性及促凋亡基因HtrA2在白血病病人中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月至2018年1月老年白血病病人156例為觀察組，其中男82例，女74例，年齡60～83歲，平均(75.39±4.51)歲；病程1～7個(gè)月，平均(3.59±0.56)個(gè)月。急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)67例，急性髓系白血病(AML)60例，慢性髓系白血病(CML)29例。選擇同期健康體檢的老年人79例為對(duì)照組，男40例，女39例，年齡60～84歲，平均(74.68±4.50)歲，2組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合老年白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且病人均經(jīng)骨穿等檢查確診；(2)接受常規(guī)化療等治療，且病人均可耐受；(3)能完成KIR2DL4基因多態(tài)性及促凋亡基因HtrA2檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并精神異常、血液系統(tǒng)疾病、器質(zhì)性疾病者；(2)合并認(rèn)知功能障礙、自身免疫系統(tǒng)疾病或其他部位惡性腫瘤者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人和(或)家屬簽署同意書(shū)。

1.3 方法

1.3.1 儀器與設(shè)備：RNA提取試劑、DL2000 DNA Marker、實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)：480II，瑞士Liggter Cycer公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；Mag Bind EZ Pure kit試劑盒(美國(guó)OMEGA Biltck公司)。

1.3.2 標(biāo)本采集：觀察組入院后次日取外周空腹靜脈血5 mL，對(duì)照組體檢當(dāng)天取外周空腹靜脈血5 mL，離心30 min，速度為3500 r/min，血清分離完畢后放置在-80℃冰箱中，備用。

1.3.3 KIR2DL4基因多態(tài)性檢測(cè)：(1)DNA提取。取上述分離的血清標(biāo)本，采用Mag Core提取試劑盒與Mag Core HF16 DNA純化自動(dòng)工作站完成DNA的提取，控制最終DNA濃度50～100 ng/μL。(2)基因分型測(cè)序。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物對(duì)KIR2DL4基因引物序列完成編碼(正向引物: 5′-TGGTGGGCCGCAGAACATGTGC-3′；反向引物: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′)，并對(duì)全部區(qū)域完成特異性PCR擴(kuò)增。采用Mag Bind EZ Pure kit試劑盒完成磁珠純化，并以PCR產(chǎn)物作為測(cè)序模板，完成正向、反向測(cè)序(采用NaOAc/EDTA、乙醇等進(jìn)行純化)。取最終獲得的純化測(cè)序產(chǎn)物，加入甲酰胺溶液13μL， 2 min變性，溫度95℃，在ABI370 DNA測(cè)序儀上進(jìn)行電泳，并將獲得序列導(dǎo)入Assign4.7 SBT分析軟件排查錯(cuò)誤堿基，確定KIR2DL4基因多態(tài)性(包括2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011、9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4)[6]。

1.3.4 促凋亡基因HtrA2檢測(cè)：(1)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取上述分離的血清標(biāo)準(zhǔn)，參考RNAison Plus說(shuō)明書(shū)提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，取上述RNA提取液，完成瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀上進(jìn)一步確定RNA是否完整；紫外分光光度計(jì)進(jìn)一步檢測(cè)RNA(A260/A280控制在1.8～2.0)，控制RNA濃度為1～2 g/L，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)完成cDNA的合成。(2)檢測(cè)方法。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定2組促凋亡基因HrA2 mRNA水平，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。設(shè)置PCR參數(shù)：30 ℃ 10min；42 ℃ 30 min；99 ℃ 5 min；5 ℃ 5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min延長(zhǎng)，獲得最終產(chǎn)物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。

表1 引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組KIR2DL4基因多態(tài)性比較 2組KIR2DL4基因多態(tài)性中2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組9A型KIR2DL4高于對(duì)照組，10A型KIR2DL4低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 觀察組與對(duì)照組KIR2DL4基因多態(tài)性比較(n)

2.2 觀察組與對(duì)照組HtrA2 mRNA水平比較 觀察組HtrA2 mRNA水平高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組中不同疾病分型病人HtrA2 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 觀察組與對(duì)照組HtrA2 mRNA水平比較

2.3 KIR2DL4基因多態(tài)性及HtrA2 mRNA表達(dá)與老年白血病病人預(yù)后的關(guān)系 對(duì)老年白血病病人進(jìn)行2年隨訪，隨訪期間死亡病人54例，死亡率為34.62%。死亡組與存活組2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008多態(tài)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)；死亡組9A型KIR2DL4檢出率、HtrA2 mRNA表達(dá)量均高于存活組(P<0.05)，10A型KIR2DL4檢出率低于存活組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 存活組與死亡組各個(gè)基因多態(tài)性比較

2.4 老年白血病病人預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 將年齡、性別、疾病分型納入Cox回歸模型校正，對(duì)老年白血病病人預(yù)后因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明：老年白血病病人預(yù)后與2DL4-006、9A型KIR2DL4基因多態(tài)性、HtrA2 mRNA表達(dá)量均有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 老年白血病病人預(yù)后影響Cox回歸分析

3 討論

KIR2DL4基因是一種結(jié)構(gòu)基因，能與HLA-G配位，傳遞、抑制信號(hào)，亦可抑制NK細(xì)胞活性，是腫瘤細(xì)胞逃逸NK細(xì)胞免疫監(jiān)控機(jī)制之一[7]。有研究結(jié)果表明：肥大細(xì)胞表面的抑制性KIR2DL4受體與HLA-G分子相互作用，能提高腫瘤細(xì)胞的侵襲性[8]。本研究中，觀察組老年白血病病人2DL4-0011、9A型KIR2DL4低于對(duì)照組(P<0.05)； 10A型KIR2DL4高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明KIR2DL4基因在老年白血病病人中表達(dá)異常。通常來(lái)說(shuō)，KIR2DL4基因配位的非經(jīng)典HLA-G分子，除了在孕婦的滋養(yǎng)層細(xì)胞膜表面表達(dá)外，在其他正常細(xì)胞中表達(dá)較低或不表達(dá)。老年白血病病人9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4等位基因表達(dá)產(chǎn)物功能上存在明顯的差異性，從而影響NK細(xì)胞對(duì)于白血病的殺傷、清除作用，導(dǎo)致老年白血病病人遠(yuǎn)期預(yù)后較差，死亡率相對(duì)較高[9]。

細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的一種主動(dòng)死亡方式，亦是細(xì)胞有機(jī)調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境的重要機(jī)制。本研究中，觀察組HtrA2 mRNA水平高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明HtrA2 mRNA水平在老年白血病病人中表達(dá)異常。HtrA2 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的由細(xì)胞核編碼的線粒體凋亡蛋白，主要存在于線粒體膜輸尿管，部分可定位于細(xì)胞核[10]。陳泓磊等[11]研究表明，HtrA2 在乳腺癌、前列腺癌及胃癌中表達(dá)較低，但是在白血病病人中呈高表達(dá)，與本研究結(jié)果相符。進(jìn)一步分析KIR2DL4基因多態(tài)性及促凋亡基因HtrA2與老年白血病病人預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明：老年白血病病人死亡組與存活組KIR2DL4基因多態(tài)性中9A型KIR2DL4、10A型KIR2DL4和HtrA2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cox回歸分析結(jié)果表明：老年白血病病人預(yù)后與KIR2DL4基因多態(tài)性及HtrA2 mRNA水平有關(guān)，說(shuō)明KIR2DL4基因多態(tài)性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中存在異常，且與病人預(yù)后關(guān)系密切，測(cè)定KIR2DL4基因多態(tài)性及促凋亡基因HtrA2表達(dá)能評(píng)估病人預(yù)后，為病人治療提供依據(jù)和參考[12]。