2,4-表油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下紫花苜蓿生理指標及根系離子積累的影響

王文靜， 麻冬梅， 趙麗娟， 馬巧利

(寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)省部共建國家重點實驗室培育基地/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點實驗室， 寧夏 銀川 750021)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由于大量施用化肥、大水漫灌以及氣候等因素的變化，使得全球鹽堿化土壤面積不斷擴增[1]。鹽脅迫會導(dǎo)致滲透脅迫、離子毒害及離子分布不平衡，阻止植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和攝取、損害細胞的結(jié)構(gòu)、擾亂細胞的生理代謝，嚴重影響植物的生長發(fā)育[2-6]。同時鹽脅迫影響植物葉片的光合作用和呼吸作用，降低植物吸水性[7]，抑制根系對植物必需營養(yǎng)元素的吸收，造成植株營養(yǎng)虧缺[8]，生育期變短，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)[9]。由于鹽堿脅迫對植物生長造成的巨大危害，尋找對鹽堿脅迫具有抑制作用的物質(zhì)以提高作物產(chǎn)量和改善鹽堿地方面具體重要意義。

2，4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)是一類對植物生長和發(fā)育具有重要影響的新激素，可促進植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，提高植物酶活性并參與植物體其他生理過程[10-13]。張紅[14]研究表明鹽脅迫下玉米(ZeamaysL.)種子經(jīng)EBR處理可提高發(fā)芽率和出苗整齊度；謝云燦等[15]研究表明，噴施外源EBR預(yù)處理不但可以通過提高常溫和高溫條件下大豆(Leguminosae)葉片的光合能力、促進干物質(zhì)積累、提高產(chǎn)量，而且提高了籽粒中蛋白質(zhì)含量、改善了籽粒品質(zhì)；陸曉民等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下噴施EBR后黃瓜(CucumissativusLinn.)幼苗根系的線粒體抗氧化酶活性升高，超氧陰離子產(chǎn)生速率、過氧化氫含量、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低，根尖細胞受損害程度降低，從而減輕了鹽脅迫對植物造成的傷害；寇江濤等[17]研究表明，EBR可增強鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)根系的活性氧清除能力，降低植物體內(nèi)活性氧含量。因此，EBR在增強植株抗逆性、提高抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)光合作用方面起著重要作用[18-19]。

苜蓿(Medicagosativa)作為優(yōu)質(zhì)的豆科類牧草，被譽為“牧草之王”[20]。苜蓿具有較強的耐鹽性，其葉片對鹽分侵害具有一定的抵抗能力，因此也是一類改善鹽堿地狀況的理想作物[21]。目前，國內(nèi)外諸多學(xué)者主要圍繞糧食類作物[8，13]、豆類作物[9]和蔬菜類作物[10，12，14]利用EBR增強植物耐鹽性進行了大量研究，而針對不同激素濃度對紫花苜蓿幼苗材料的研究相對較少，且研究領(lǐng)域以光合特性和膜滲透調(diào)節(jié)為主，而對鹽脅迫條件下植物體內(nèi)關(guān)鍵酶活性和離子吸收分配的調(diào)節(jié)效應(yīng)缺乏機理性研究。為此，本研究以紫花苜?！⒌夏取癁樵囼灢牧希骄客庠醇に谽BR對鹽脅迫下苜蓿幼苗生理特性及離子分配與吸收的影響，以期為利用EBR增強苜蓿耐鹽性能的生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗選擇紫花苜蓿‘阿迪娜’為材料，該材料來自于寧夏大學(xué)種質(zhì)資源庫。于2019年5—9月在寧夏大學(xué)西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點實驗室人工氣候室(38°30′ N，106°8′ E)進行試驗。苜蓿種子用0.1% HgCI2消毒8 min，然后用75%酒精消毒30 s，再用蒸餾水漂洗5～6遍，將清洗消毒之后的種子均勻鋪在放好濾紙的培養(yǎng)皿中，并將濾紙用蒸餾水噴濕，放入人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)至種子發(fā)芽(24～26℃)。待幼苗長至兩葉一心時移至裝有3L Hoagland，s營養(yǎng)液的水培箱進行培養(yǎng)，每3 d更換一次營養(yǎng)液。在營養(yǎng)液中培養(yǎng)30 d后開始處理。

試驗設(shè)置 5個處理，分別為CK(澆灌營養(yǎng)液)、150 mmol·L-1NaCl(N)，150 mmol·L-1NaCl+0.3 μmol·L-1EBR(M1)、150 mmol·L-1NaCl +0.6 μmol·L-1EBR(M2)、150 mmol·L-1NaCl +1.2 μmol·L-1EBR(M3)，每個處理3個重復(fù)。連續(xù)處理7 d后測定各項指標。

1.2 指標測定

生理指標測定方法：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 活性測定采用氮藍四唑光還原法；過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定吸光值；過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用紫外吸收法測定；丙二醛含量采用李合生的硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法，具體步驟可參考趙世杰等的測定方法[22]。

無機離子含量測定：將植株的根系用去離子水潤洗干凈，并將水分用吸水紙吸干，采用干燥法對干物質(zhì)量進行測定。將各處理的干樣粉碎、研磨和過篩，根據(jù)毛美飛等[23]方法測定Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖，用SPSS 18.0軟件中的鄧肯新復(fù)極差法進行單因素方差分析和多重比較(LSD<0.05)、相關(guān)性分析，并用不同字母標注差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素EBR對紫花苜蓿幼苗生長及表型的影響

與CK相比，150 mmol·L-1NaCl降低了紫花苜蓿生長指標，其中根長變化最明顯，降幅達45.3%。M1處理各項指標變化小，與CK差異不顯著。M2，M3處理根長和根粗與CK相比有所提高(表1)。由于水培條件下鹽溶液中的Na+和CI-1可直接迅速侵入根系，因此在脅迫后很短的時間內(nèi)苜蓿幼苗就出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，但在噴施不同濃度的外源激素EBR 2～3 h后，幼苗莖葉萎蔫現(xiàn)象緩解，逐漸恢復(fù)到鹽脅迫前的表型(圖1)。說明就表型特征而言，外源激素EBR對鹽脅迫的危害具有一定緩解作用。

表1 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗生長的影響Table 1 Effects of exogenous EBR on the growth of Alfalfa seedlings under salt stress

圖1 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗表型的影響Fig.1 Effect of exogenous hormone EBR on alfalfa seedling phenotype under Salt Stress

2.2 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，鹽脅迫會大幅度降低苜蓿幼苗葉片的抗氧化酶活性。葉片中SOD，POD，CAT活性隨著EBR濃度的升高出現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢，并最終低于對照。與150 mmol·L-1NaCl脅迫相比，M1，M2和M3處理時苜蓿幼苗的抗氧化酶活性均升高，且M2處理下升高趨勢達顯著性差異，說明外源激素EBR濃度為0.6 μmol·L-1時可以顯著提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性，減輕鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的影響。

圖2 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of exogenous hormone EBR on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under NaCl stress

2.3 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質(zhì)滲透率的影響

由圖3可知，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，苜蓿幼苗葉片中的電解質(zhì)滲透率和MDA含量升高，顯著高于對照(P<0.05)。鹽脅迫下添加0.6 μmol·L-1外源激素EBR顯著降低了NaCl脅迫導(dǎo)致的電解質(zhì)滲透和MDA積累。丙二醛含量越高，對膜和細胞造成的傷害越大，說明外源激素EBR可以減少鹽脅迫對植物細胞過氧化的危害，提高植株對逆境脅迫的適應(yīng)性。

圖3 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片丙二醛含量及電解質(zhì)滲透率的影響Fig.3 Effects of exogenous hormone EBR on MDA content and electrolyte permeability of alfalfa seedling leaves under NaCI Stress

2.4 外源激素EBR對NaCI脅迫下苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，與對照相比，鹽脅迫處理下苜蓿幼苗的可溶性蛋白含量顯著下降(P<0.05)；鹽脅迫時噴施不同濃度外源激素EBR后，幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均有提高，M2處理上升趨勢最明顯，但含量均低于沒有鹽脅迫影響。說明鹽脅迫使苜蓿幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，影響植物體內(nèi)氮素的形成和正常的滲透勢過程，破壞可溶性蛋白對植物細胞和生物膜的保護作用，而適當濃度(0.6 μmol·L-1)的外源激素EBR可以抑制鹽脅迫的部分影響。

圖4 不同處理下可溶性蛋白含量變化Fig.4 Changes of soluble protein content under different treatments

2.5 外源激素EBR對鹽脅迫下苜蓿幼苗無機離子含量的影響

150 mmol·L-1NaCl處理下苜蓿幼苗根系中的Na+含量顯著升高，K+，Ca2+和Mg2+含量顯著降低(P<0.05)(圖5)。和CK相比，NaCl處理苜蓿幼苗葉片中的Na+含量提高了32.8%(P<0.05)，K+，Ca2+，Mg2+含量分別降低了57.1%，69.7%和19.2%。由圖5可知，M1處理Na+含量與對照相比上升，與鹽脅迫處理相比含量下降；M1處理K+含量較對照下降了22.8%(P<0.05)，比鹽脅迫處理略有上升；M1處理Ca2+和Mg2+含量均低于CK處理，但高于鹽脅迫處理，分別提高了30.7%和29.1%。M2處理苜蓿幼苗根系的Na+含量顯著低于NaCl處理的Na+離子含量，K+，Ca2+和Mg2+含量均遠遠高于NaCl處理，分別提高53.8%，66.7%，31.2%(P<0.05)。M3處理其離子含量變化趨勢同M2，Na+含量低于鹽脅迫處理，K+,Ca2+和Mg2+含量均高于鹽脅迫。綜上所述，150 mmol·L-1NaCl使植物體內(nèi)K+，Ca2+和Mg2+等陽離子含量下降，噴施外源激素EBR可以有效減小鹽脅迫的危害并且控制植物體內(nèi)離子平衡和對植株根系生長的影響以及根系對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收促進，0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿較為適應(yīng)的激素濃度。

3 討論

在我國南北方許多地區(qū)存在大量鹽堿地，對各類植物造成危害，不同基因型植物對鹽害的適應(yīng)能力不同[26]。有大量研究報道，土壤中的含鹽量在超過0.2%～0.25% 時就會對敏鹽植株正常生長造成危害，耐鹽植物可忍受鹽分濃度為0.5%～1.8%。在我國西北地區(qū)、華北地區(qū)、東北部分和海濱等地分布有大量鹽堿地，總面積大約(2～7)×107ha[27]。鹽脅迫條件下，敏鹽種子的萌發(fā)受到抑制，同時植株的發(fā)芽率、干鮮重等顯著降低。寇江濤[17]、王小山[18]等研究表明，外源激素EBR可以緩解鹽脅迫對植株生長造成的影響。本試驗中，施加微量外源激素EBR便可提高紫花苜蓿幼苗中的抗氧化酶活性，使植株的可溶性蛋白含量增加，而對苜蓿幼苗的丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率具有一定的抑制作用，抗氧化酶可以有效地清除膜質(zhì)過氧化物對植物造成的傷害，其活性越高，植物對逆境的適應(yīng)能力越強[19]，因此外源激素EBR可在一定程度上緩解膜脂過氧化對苜蓿幼苗造成的傷害，增強植物對逆境脅迫的抵抗能力，減輕鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的影響，這一結(jié)論也與梁超[24]、鄒琦[25]等的研究結(jié)果相似。相對而言鹽溶液明顯抑制抗氧化酶活性，提高丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率，這也和前人的研究結(jié)果相似[14-18]。由此可知，適量濃度的外源激素EBR對鹽脅迫的抑制作用明顯，可加強植物的耐鹽性，對鹽脅迫生態(tài)系統(tǒng)的改善具有很好的效果。

在對離子的研究方面，K+影響著植物體的水分和光合利用,淀粉以及蛋白質(zhì)合成，是構(gòu)成細胞滲透勢的主要離子[28]，其濃度高低對氣孔的開閉有調(diào)節(jié)作用。Ca2+調(diào)節(jié)植物體的許多生理代謝過程，在植物的信號傳導(dǎo)過程中充當?shù)诙攀筟29]，能夠提高植物對逆境的適應(yīng)性。Mg2+與植物的光合作用密切相關(guān)，是組成葉綠素的重要分子，確保光合磷酸化的正常進行[30]。本試驗中，NaCl脅迫下紫花苜蓿根中的K+，Ca2+，Mg2+含量顯著下降，Na+含量顯著升高，表明濃度較高的Na+對K+，Ca2+，Mg2+3者的吸收有抑制作用，打破了植物體內(nèi)的正常離子含量和離子分布；較低濃度的外源激素EBR (0.6 μmol·L-1)可以降低植株體內(nèi)的Na+含量，提高植株體內(nèi)其他離子含量，維持離子平衡。以上結(jié)果可能是由于外源激素EBR提高了NaCl脅迫下植物的根系活力和光合能力[31]，同時外源激素EBR可以調(diào)控植物根系中內(nèi)源植物激素的合成[32]，從而有效調(diào)控無機離子的吸收、運輸和分配，減少鹽脅迫危害。

4 結(jié)論

極低濃度的外源激素EBR可以有效地減輕鹽脅迫的危害，使植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性升高，葉綠素含量和可溶性蛋白含量增加，丙二醛含量以及電解質(zhì)滲透率下降；并且外源激素EBR可有效抑制Na+對K+，Ca2+,Mg2+的毒害，控制離子平衡；0.6 μmol·L-1EBR為紫花苜蓿受鹽脅迫較為適應(yīng)的激素濃度。不同物種在逆境條件下對外源激素EBR的適應(yīng)程度有差異，EBR可以快速有效地影響苜蓿等一些牧草生長，對提高鹽堿地牧草對逆境的耐受力，提高產(chǎn)量，改善生長狀況具有重要意義。