優(yōu)化鹽酸濃度、水解時間和氫氧化鈉量改善糖原含量鑒定效果*

黎威巍，李菁琦，李 彥，張 燕，金科華

(湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100)

饑餓與飽食對肝糖原含量的影響是一個重要的綜合性生化實驗，該實驗通過糖原水解產物與班氏試劑反應生成磚紅色氧化亞銅的量來判斷糖原含量的高低。筆者按本教研室實驗教程[1]帶教時，發(fā)現(xiàn)從飽食小鼠的肝臟提取的糖原水解產物與班氏試劑反應沉淀量太少或無沉淀。實驗失敗易導致學生喪失實驗興趣，降低教師帶教的激情。為解決這一問題，我們對水解糖原的鹽酸濃度、水解時間及氫氧化鈉的量進行優(yōu)化，顯著改善了糖原鑒定效果，現(xiàn)予以報道。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

家兔由我校動物室提供。分析純三氯乙酸、氫氧化鈉為天津歐博凱化工有限公司產品，濃鹽酸為國藥集團化學試劑有限公司產品。分別將三氯乙酸、氫氧化鈉溶于蒸餾水，配制5%三氯乙酸、20%氫氧化鈉各200mL。B-廣范試紙(pH1-14)為上海三愛思試劑有限公司產品。

1.2 糖原的提取

將家兔頸椎脫臼處死，取20g肝臟，分成10等分，剪碎，每份加6mL 5%三氯乙酸，制備勻漿。勻漿于3 600r/min室溫離心4min(下同)。上清液轉移至另一離心管中，加等體積無水乙醇，混勻，離心。棄上清，將離心管倒扣于紙巾上，吸干殘存液體，50℃烘干，取風干的糖原400mg溶于10mL蒸餾水，配制40mg/mL糖原溶液。

1.3 鹽酸濃度對糖原水解的影響

取5支1.5mL EP管，依次編號為1、2、3、4、5，按表1依次加入糖原溶液，蒸餾水和濃鹽酸，渦旋混勻，置沸水浴反應5min，取出，置冰水中冷卻2min。取糖原水解20 μL于反應板上，與等體積的 0.3%碘液混勻，比較紅褐色深淺。見表1。

表1 鹽酸濃度對糖原水解的影響

1.4 時間對糖原水解的影響

取8支1.5mL EP管，依次編號為1、2、3、4、5、6、7、8，按表2依次加入糖原溶液和濃鹽酸，渦旋混勻，置沸水浴水解0～3.5min，取出，置冰水中冷卻2min。取糖原水解10μL于反應板上，與等體積的0.3%碘液混勻，比較紅褐色深淺。見表2。

表2 水解時間對糖原水解的影響

1.5 氫氧化鈉濃度對班氏試劑反應的影響

將4mL糖原溶液與800μL濃鹽酸渦旋混勻，按650μL/管分裝至5支1.5mL EP管中，沸水浴反應3.5min，取出，置冰水中冷卻2min。按表3加入氫氧化鈉和蒸餾水，渦旋混勻。取中和后的水解液300μL分別與150μL班氏試劑渦旋混勻，置沸水浴中反應3min，取出，置冰水中冷卻2min，記錄沉淀量。見表3。

表3 氫氧化鈉量對班氏試劑反應的影響

2 結 果

2.1 鹽酸濃度對糖原水解的影響

鹽酸濃度對糖原水解影響的結果見圖1(封三)，由圖可知，糖原水解速度隨鹽酸終濃度增大而加快。終濃度0.5mol/L的鹽酸，即可有效水解糖原；鹽酸終濃度達到2mol/L及以上時，5min內即可將反應體系中的糖原完全分解。

2.2 時間對糖原水解影響

終濃度2mol/L的鹽酸反應時間對糖原水解影響的結果見圖2(封三)?？芍?，隨時間加長，糖原水解程度加深，至3.5min時，糖原完全水解。

2.3 氫氧化鈉中和鹽酸的最佳用量

不同體積的氫氧化鈉中和水解產物中的鹽酸后，中和液與班氏試劑反應的結果見圖3(封三)。由圖知，不加氫氧化鈉(圖3A)及加300μL氫氧化鈉(圖3B)中和的管均無沉淀生成；加380μL氫氧化鈉中和的管開始出現(xiàn)磚紅色沉淀(圖3C)；加420μL氫氧化鈉的管沉淀明顯增多(圖3D)；當氫氧化鈉為460μL時，沉淀較之380μL未見增多(圖3E)。綜上可知，隨中和鹽酸所用氫氧化鈉量的增加，水解產物與班氏試劑反應的沉淀從無到有，從少到多，當氫氧化鈉為420μL時，沉淀量達最大值。

3 討 論

沸水浴時，鹽酸催化糖原水解為葡萄糖。諸多實驗教程[2-4]都限定了水解糖原所用濃鹽酸體積和反應時間，未探究鹽酸終濃度對水解反應速度的影響，便用氫氧化鈉中和鹽酸，終止水解反應，取糖原水解液與班氏試劑反應。如此操作，若糖原水解不充分，生成的葡萄糖少，易導致水解產物與班氏試劑反應生產的氧化亞銅沉淀不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽酸濃度增加和水解時間延長，糖原水解程度增加。為此，筆者建議實驗者在用氫氧化鈉中和鹽酸前，取少量水解液和水解前的糖原分別與碘液反應，判斷糖原水解程度，確認水解完全，再用氫氧化鈉終止水解反應。

弱堿性的班氏試劑與葡萄糖反應生成磚紅色沉淀[5]。在酸性環(huán)境中，班氏試劑中的Cu2+較為穩(wěn)定，不容易與葡萄糖發(fā)生反應。為此，中和糖原水解液中的鹽酸，使水解液呈堿性是班氏試劑與葡萄糖反應的前提。中和水解液中的鹽酸所用的氫氧化鈉量與磚紅色深淺的關系未見文獻報道。實驗教程中用6～8滴20%的氫氧化鈉中和水解反應中的10滴濃鹽酸，并強調滴加的氫氧化鈉中和液以使石蕊試紙剛變藍為宜。濃鹽酸摩爾濃度為12mol/L，20%氫氧化鈉摩爾濃度為5mol/L，理論上，中和本反應體系中濃鹽酸的所需氫氧化鈉體積為鹽酸體積的2.4倍。可見，教程中中和鹽酸所用的氫氧化鈉量遠遠不夠。340μL氫氧化鈉中和水解液中的150鹽酸后，中和液剛使pH試紙變藍(少于此體積，試紙不變藍)，但此時并沒有沉淀生成。當氫氧化鈉的增加至380μL時，中和液與班氏試劑反應才出現(xiàn)磚紅色沉淀，隨氫氧化鈉體積增加，沉淀逐漸加深；當氫氧化鈉達到420μL時，磚紅色達到最深，繼續(xù)增加氫氧化鈉，磚紅色不再加深。

班氏試劑通過其成分中的碳酸鈉維持弱堿性環(huán)境。圖3A和3B管中的水解液中的鹽酸若未經氫氧化鈉中和或氫氧化鈉的量不夠，加入班氏試劑即產生大量氣泡，表明水解液中的鹽酸分解碳酸鈉，破壞弱堿性環(huán)境，導致無氧化亞銅沉淀生成。