外源性硫化氫對顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其對NF-κB/IκB調(diào)節(jié)機(jī)制研究

周衛(wèi)　　胡曉華　　劉克洪　　王曉陽　　白弘照　　袁毅　　高劉傳

[摘要] 目的 研究外源性硫化氫對顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其對核因子Kappa B/抑制蛋白（NF-κB/IκB）調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法 60只雄性SD大鼠簡單隨機(jī)化法分為對照組、模型組、低/中/高劑量硫化氫組，每組各12只。對照組常規(guī)管理，模型組構(gòu)建PTSD動物模型。低劑量硫化氫組以幽閉電擊法建立PTSD模型，電擊前20 min給予1.68 mg/kg硫氫化鈉（NaHS）腹腔注射處理;中劑量硫化氫組以幽閉電擊法建立PTSD模型，電擊前20 min給予3.20 mg/kg NaHS腹腔注射處理;高劑量硫化氫組以幽閉電擊法建立PTSD模型，電擊前20 min給予6.40 mg/kg NaHS腹腔注射處理。比較各組Morris水迷宮（MWM）評分、大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評分標(biāo)準(zhǔn)（NSS）評分、海馬區(qū)細(xì)胞凋亡灰度值、NF-κB/IκB通路p65、pIκBα/IκBα表達(dá)情況，并觀察各組海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。 結(jié)果 模型組逃避潛伏期、NSS評分高于對照組，穿越平臺位置次數(shù)、在原平臺所在象限的時間占比低于對照組（P<0.05）;硫化氫組以上指標(biāo)改善顯著（P<0.05）;高劑量硫化氫組與對照組逃避潛伏期、穿越平臺位置次數(shù)、在原平臺所在象限的時間占比、NSS評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）; 模型組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡灰度值高于其他各組（P<0.05）;硫化氫組灰度值改善顯著（P<0.05）。模型組p65、pIκBα/IκBα高于對照組（P<0.05），硫化氫組改善明顯（P<0.05）。 結(jié)論 外源性硫化氫對顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，可減少海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡，抑制NF-κB/IκB通路表達(dá)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，NF-κB/IκB豐富生理功能為PTSD多靶點(diǎn)治療提供了新思路。

[關(guān)鍵詞] 顱腦創(chuàng)傷;神經(jīng)保護(hù);NF-κB/IκB;外源性硫化氫;應(yīng)激障礙

[中圖分類號] R563.8? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）11-0030-06

The neuroprotective effect of exogenous hydrogen sulfide on rats with post-traumatic stress disorder and the mechanism of its regulation on NF-κB/IκB

ZHOU Wei HU Xiaohua LIU Kehong WANG Xiaoyang? ?BAI Hongzhao? ?YUAN Yi? ?GAO Liuchuan

Department of Rehabilitation， Zhejiang Provincial Armed Police Corps Hospital， Hangzhou? ?310051， China

[Abstract] Objective To study the neuroprotective effect of exogenous hydrogen sulfide on rats with post-traumatic stress disorder and the mechanism of its regulation on nuclear factor Kappa B/inhibitory protein （NF-κB/IκB）. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into the control group， the model group， and the low/medium/high-dose hydrogen sulfide group，with 12 rats in each group. The control group was routinely managed， and the model group buildt PTSD animal models. The low-dose hydrogen sulfide group was treated with a claustrophobic electric shock to establish a PTSD model， and 1.68 mg/kg sodium hydrosulfide（NaHS） was injected intraperitoneally 20 minutes before the electric shock. The medium-dose hydrogen sulfide group was treated with a claustrophobic electric shock to establish a PTSD model， which was given 3.20 mg/kg NaHS intraperitoneal injection treatment 20 minutes before the electric shock. The high-dose hydrogen sulfide group was treated with claustrophobic shock method to establish PTSD model， and 6.40 mg/kg NaHS intraperitoneal injection treatment was given 20 minutes before the shock. The Morris water maze（MWM） scores， the scores of severe neurological deficits（NSS） scores， hippocampal cell apoptosis gray values，NF-κB/IκB pathway p65， pIκBα/IκBα expression in each group were compared. The hippocampus cell morphology characteristics in each group were compared. Results The escape latency and NSS scores of the model group were higher than those of the control group. The number of crossing the platform and the proportion of time in the quadrant of the original platform of the model group were lower than those of the control group（P<0.05）. The above indicators in the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. There was no statistically significant difference between the hydrogen sulfide group and the control group in the escape latency， the number of crossing the platform position， the proportion of time in the quadrant where the original platform was located， and the NSS score（P>0.05）. The gray value of apoptosis in the hippocampus of the model group was higher than that of the other groups（P<0.05）. The gray value of the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. The p65 and pIκBα/IκBα in the model group were higher than those in the control group（P<0.05）， and the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. Conclusion Exogenous hydrogen sulfide has a neuroprotective effect on post-traumatic stress disorder model rats. It can reduce hippocampal cell apoptosis and inhibit the expression of NF-κB/IκB pathway in a dose-dependent manner.The abundant physiological functions of NF-κB /IκB provide new ideas for multi-target therapy of PTSD.

[Key words] Craniocerebral trauma; Neuroprotection; NF-κB/IκB; Exogenous hydrogen sulfide; Stress disorder

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（Post-traumatic stress disorder，PTSD）是由于個體遭受創(chuàng)傷或應(yīng)激事件而導(dǎo)致的精神障礙，病程較長，可達(dá)數(shù)月或數(shù)年[1]。PTSD的臨床治療方法包括藥物治療與心理干預(yù)，其發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制為臨床研究的熱點(diǎn)。國外科學(xué)家Goodwin在1989年首次檢測到腦內(nèi)游離硫化氫，能通過減少谷氨酸合成釋放、抗氧化等調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)，參與情緒、學(xué)習(xí)能力等調(diào)節(jié)。PTSD的主要臨床表現(xiàn)為情緒異常以及學(xué)習(xí)能力的下降，因此有學(xué)者提出，可以嘗試通過補(bǔ)充外源性硫化氫來提升PTSD的治療效果。核因子Kappa B（NF-κB）及其抑制蛋白（Inhibition Kappa B，IκB）在機(jī)體多種細(xì)胞的生物學(xué)行為中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于以上兩者在PTSD中的作用尚無相關(guān)研究。本研究通過建立PTSD大鼠模型，從NF-κB/IκB信號的視角探討了硫化氫對PTSD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)生物

研究對象為蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的清潔級SD大鼠，共計(jì)60只，體質(zhì)量200～300 g，平均體重（256.83±28.30）g，所有大鼠均在室溫（25±2）℃的環(huán)境下自由攝食。動物許可證號SCXK（蘇）20120005。

1.2 儀器及試劑

恒溫孵育箱（山東歐萊博儀器有限公司，型號：DHP-9054B）;顯微鏡（OLYMPUS BX50，日本）;電泳儀（Light Cycler 480，美國）。p65、IκBα、ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒;Lamin、pIκBα、βactin、IκBα、p65抗體;組織蛋白抽提試劑盒;聚丙烯酰胺凝膠;NaHS，試劑盒均購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.3 分組與造模

1.3.1 分組? 隨機(jī)將60只大鼠分為對照組、模型組、低/中/高劑量硫化氫組，每組各12只。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何其他操作。模型組以幽閉電擊法建立PTSD模型;低劑量硫化氫組以幽閉電擊法[4]建立PTSD模型。將大鼠置于密閉不透光的小電擊箱中，箱子下部為可通過電流的不銹鋼柵欄，柵欄與自制電刺激發(fā)生器相連。箱體的左右壁、后壁及頂壁由不透光樹脂材料制成，箱體內(nèi)固定一小型數(shù)碼攝像頭方便觀察大鼠行為。電刺激發(fā)生器自行設(shè)計(jì)，可提供 0～10 mA 恒定電流刺激。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于箱中熟悉幽閉電擊箱30 min。對照組放于箱中同樣時間但是不予以刺激。大鼠處于無法逃避足部受到持續(xù)電流刺激的狀態(tài)，刺激電流強(qiáng)度 8 mA，刺激時間10 s，刺激間隔隨機(jī)，每次刺激 30 min。上下午各一次，間隔不少于4 h。連續(xù)3 d。電擊結(jié)束大鼠仍放在原籠飼養(yǎng)。每個動物完成后用 75%酒精徹底清潔電擊箱。低劑量硫化氫組電擊前20 min給予1.68 mg/kg硫氫化鈉（NaHS）腹腔注射處理;中劑量硫化氫組以幽閉電擊法建立PTSD模型，電擊前20 min給予3.20 mg/kg NaHS腹腔注射處理;高劑量硫化氫組以幽閉電擊法建立PTSD模型，電擊前20 min給予6.40 mg/kg NaHS腹腔注射處理。

1.3.2 PTSD大鼠模型建立? 大鼠每日上午接受電擊處理（電流8 mA、電壓60 V），每次10 s，持續(xù)時間30 min，每次電擊之間間隔3 s;6 h后重復(fù)以上電擊操作。持續(xù)時間為7 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 各組神經(jīng)功能指標(biāo)比較? Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）[2]評分、大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評分標(biāo)準(zhǔn)（Neurological severity scores，NSS）[3]評分。MWM實(shí)驗(yàn)：將恒溫游泳池（直徑160 cm）設(shè)置為20℃，水深40 cm，站臺高度20～35 cm，水平面高于池中平臺1 cm，對大鼠進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠逃避潛伏期、游泳軌跡，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析大鼠穿越平臺位置次數(shù)及在原平臺所在象限的時間占比。訓(xùn)練時間為5 d。NSS評分方法：提鼠尾離開地面，高度為1尺，觀察大鼠前肢狀態(tài)并計(jì)分。0分：神經(jīng)功能正常，行走正常，前肢對稱性地伸向地面;1分：神經(jīng)功能缺損，前肢屈曲，行走基本正常;2分：神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，前肢內(nèi)收，行走傾斜;3分：神經(jīng)功能重度缺損，行走路徑為圈狀，前肢狀態(tài)為內(nèi)收;4分：神經(jīng)功能基本喪失，無法行走，意識減退;5分：死亡。

1.4.2 觀察各組海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征? 隨機(jī)各取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定，顯露顱骨，取適量海馬區(qū)標(biāo)本，制作石蠟切片（厚度為5 μm），進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。

1.4.3 各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較? 取適量海馬區(qū)組織，同1.4.2中方法。制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，顯微鏡觀察切片染色情況，應(yīng)用Motic Image Advanced 3.2軟件記錄細(xì)胞凋亡灰度值。

1.4.4 各組NF-κB/IκB通路蛋白表達(dá)情況比較? 按照4∶1的比例，于100℃環(huán)境下配置5×蛋白上樣和緩沖液的混合溶液，于室溫環(huán)境下進(jìn)行5 min的充分變性處理。將100 μg蛋白分別添加到100 g/L、80 g/L濃縮膠的孔中，然后對其進(jìn)行電泳處理，處理電壓分別為80 V、110 V，處理電流均為200 mA，完成蛋白質(zhì)到0.22 μm的PVDF膜上的轉(zhuǎn)錄。取1∶3000、1∶1000、1∶2000兔抗人p65、pIκBα/IκBα抗體，利用50 g/L完全脫脂純牛奶在4℃環(huán)境下?lián)u床過夜培養(yǎng)，分3次對膜進(jìn)行沖洗，沖洗溶液選擇TBST溶液洗膜，每次沖洗時間為5 min，進(jìn)一步標(biāo)定處理后，對其蛋白吸光度值進(jìn)行分析，分析軟件采用最新版本的Odyssey。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩組之間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)。組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能指標(biāo)比較

高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組、模型組、對照組間的各指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組逃避潛伏期、NSS評分顯著高于對照組（P<0.05）;模型組的穿越平臺位置次數(shù)、在原平臺所在象限的時間占比顯著低于對照組（P<0.05）;高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組的逃避潛伏期、NSS評分均顯著低于模型組（P<0.05）;高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組的穿越平臺位置次數(shù)、在原平臺所在象限的時間占比均顯著高于模型組（P<0.05），且3組硫化氫劑量越高，以上指標(biāo)改善越明顯（P<0.05）;高劑量硫化氫組與對照組逃避潛伏期、穿越平臺位置次數(shù)、在原平臺所在象限的時間占比、NSS評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)

對照組海馬區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，染色淺，細(xì)胞排列緊密。模型組海馬區(qū)細(xì)胞染色深淺不一，細(xì)胞體積較小，排列疏松，可見神經(jīng)元變性的現(xiàn)象。低劑量硫化氫組的海馬區(qū)觀察結(jié)果顯示，神經(jīng)元數(shù)目有減少的現(xiàn)象，細(xì)胞間排列略顯紊亂。中劑量硫化氫組的海馬區(qū)觀察結(jié)果顯示，神經(jīng)元受損情況明顯，細(xì)胞排列大致正常。高劑量組可見緊密而整齊的細(xì)胞排列，細(xì)胞核邊界清晰。

2.3 各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較

高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組、模型組、對照組，組間的海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組細(xì)胞凋亡灰度值最高。

2.4 各組NF-κB/IκB通路表達(dá)比較

對照組、模型組、高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組的p65的表達(dá)水平分別為（0.31±0.04）、（1.68±0.04）、（0.30±0.02）、（0.67±0.03）、（1.04±0.05），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.236，P<0.05）。對照組、模型組、高劑量硫化氫組、中劑量硫化氫組、低劑量硫化氫組的pIκBα/IκBα值分別為（0.07±0.02）、（2.13±0.09）、（0.10±0.02）、（0.22±0.03）、（0.55±0.07），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.023，P<0.05）。模型組的表達(dá)水平最高。

3 討論

硫化氫在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，是一種氣態(tài)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。神經(jīng)系統(tǒng)中硫化氫由神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，呈游離狀態(tài)，能特異性與三磷酸腺苷敏感鉀通道作用，具有降低神經(jīng)元興奮性作用，且可利用胱硫醚-γ-裂解酶（CSE），而CSE分布具有特異性，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，提示在中樞中可能有定位的硫化氫區(qū)域[4-6]。國外相關(guān)資料指出，硫化氫能通過環(huán)狀核苷酸途徑促進(jìn)海馬長期增益效應(yīng)，從而增強(qiáng)認(rèn)知，提高學(xué)習(xí)記憶能力[7-8]。且以往報(bào)道顯示，硫化氫能通過增加離子型谷氨酸受體調(diào)節(jié)海馬依賴情景型恐懼記憶[9-11]。崔永華等[12]發(fā)現(xiàn)，硫化氫能改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性腦血管痙攣。本研究以NaHS腹腔注射，進(jìn)入血液后可快速發(fā)生反應(yīng)，補(bǔ)充外源性硫化氫，結(jié)果顯示模型組的神經(jīng)功能各評價指標(biāo)值均與對照組存在明顯的差異。說明PTSD大鼠存在顯著的神經(jīng)功能受損情況，也提示硫化氫對PTSD大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。

海馬是機(jī)體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的重要中樞[13-15]，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時，海馬區(qū)較容易受到損傷，對PTSE患者的認(rèn)知及情緒均產(chǎn)生重要的影響[16-20]。陳旺等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，PTSE大鼠的海馬區(qū)域細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)量較少。本研究中，PTSE大鼠的海馬區(qū)細(xì)胞排列及狀態(tài)、染色情況、神經(jīng)元等均與對照組差異明顯，而經(jīng)硫化氫處理后，以上狀況明顯改善。證實(shí)了硫化氫對海馬區(qū)細(xì)胞的保護(hù)作用。殷莉等發(fā)現(xiàn)[22]，PTSD患者的海馬體積變化與海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況密切相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況最為明顯，而經(jīng)過硫化氫處理后，減少了PTSD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡，且在一定范圍內(nèi)，硫化氫劑量越高，效果越佳，這亦是其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。

NF-κB/IκB通路參與機(jī)體炎癥、細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程[23-25]，NF-κB與IκB通常以復(fù)合物形式存在，當(dāng)受到外在因素刺激時，可發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥、免疫等過程[26-29]。PTSD的發(fā)生發(fā)展涉及多種病理機(jī)制，較為復(fù)雜。陶曉剛等[30-31]在研究中分析了顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織中NF-κB蛋白的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示，NF-κB蛋白水平表達(dá)異常。楊璽等[32]在研究中分析了創(chuàng)傷性腦損傷患者的p65蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，其與腦損傷的程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組p65、pIκBα/IκBα呈高表達(dá)狀態(tài)，且硫化氫的處理能夠降低p65、pIκBα/IκBα的表達(dá)水平，說明硫化氫可能通過抑制NF-κB/IκB通路的方式來實(shí)現(xiàn)PTSD的治療。值得注意的是，本研究為避免硫化氫給藥時間對結(jié)果的影響，硫化氫處理組NaHS均在電擊前20 min腹腔注射，關(guān)于其在電擊后注射對大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用、NF-κB/IκB通路影響是否與電擊前20 min相同有待后續(xù)深入探討。

綜上所述，外源性硫化氫對顱腦創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，可減少海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡，抑制NF-κB/IκB通路表達(dá)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，NF-κB/IκB豐富生理功能為PTSD多靶點(diǎn)治療提供了新思路。

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（收稿日期：2020-10-26）