王 昱，白 潔，張志強(qiáng)，張隸濤，孫 菡*

（1. 秦皇島市藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，河北 秦皇島 066000；2. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000）

大黃蟄蟲(chóng)片是由熟大黃、土鱉蟲(chóng)、虻蟲(chóng)、水蛭、白芍、黃芩、甘草等十二種藥味加工而成的中藥成方制劑，為漢代名醫(yī)張仲景所著《金匱要略血痹虛勞篇》中的經(jīng)典名方，具有活血破瘀，通經(jīng)消痞之功效，臨床上廣泛用于肝病、婦科疾病、心腦血管疾病等的治療，該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) YBZ12252005-2012Z-3[1-4]，標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了大黃中大黃素、大黃酚的含量測(cè)定方法。本次研究為了更高效地控制中藥成方制劑質(zhì)量，采用高效液相法進(jìn)行多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定方法研究[5-10]，以處方中白芍、黃芩、甘草的指標(biāo)性成分為質(zhì)控基礎(chǔ)，建立了同時(shí)測(cè)定3種成分含量的測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)便，方法準(zhǔn)確，為本品質(zhì)量控制提供了更加全面有效的定量分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]；Boston C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AE240分析天平（Metler精密儀器分析公司，感量0.01 mg）；KQ -500KDE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司500W 40 kHz）。

1.2 試劑試藥

對(duì)照品：黃芩苷（批號(hào)110715-201318），甘草苷（批號(hào)111610-201106），芍藥苷（批號(hào)110736-201741）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

樣品：大黃蟄蟲(chóng)片，廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)分別為：860003，860005，860007，860008，860009，860030，860032，860034，860036，860037。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Boston C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A；以 0.1 mol/L磷酸為流動(dòng)相B；按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：30 ℃。流速為1.0 ml/min；測(cè)定波長(zhǎng)230 nm。理論塔板數(shù)：需按芍藥苷峰計(jì)算不得低于3000；各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別取3種待測(cè)成分對(duì)照品約 10 mg，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制成每1 ml含芍藥苷、黃芩苷各200 μg，甘草苷100 μg溶液。各精密量取5 ml，置入20 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品20片，稱(chēng)定重量，研細(xì)，精密稱(chēng)取1 g，精密加入70 %乙醇溶液25 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，用70 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn)中[處方]及[制法][2]項(xiàng)下制備白芍、黃芩、甘草陰性樣品，按上述2.2.2項(xiàng)下制備陰性樣品溶液。分別精密吸取芍藥苷、甘草苷、黃芩苷的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置顯相同保留時(shí)間色譜峰，而陰性樣品色譜的相應(yīng)位置無(wú)色譜峰，陰性不干擾測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 大黃蟄蟲(chóng)片中芍藥苷、甘草苷、黃芩苷含量測(cè)定圖

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷峰面積RSD分別為0.5 %，0.9 %，0.6 %，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液適量，加甲醇配置成系列濃度對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄所有的峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各待測(cè)成分線性關(guān)系良好，線性回歸方程見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取大黃蟄蟲(chóng)片樣品（批號(hào)：860032），精密稱(chēng)取0.5，1.0，1.5 g各3份，共取9份，按 “2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷平均含量分別為0.815，0.123，1.212 mg/g；RSD分別為1.3 %，1.8 %，0.9 %，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.7 準(zhǔn)確度（回收率）試驗(yàn)

采用高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照品加于樣品中的回收測(cè)定法。取大黃蟄蟲(chóng)片樣品（批號(hào)：860032，含量以重復(fù)性結(jié)果計(jì)）9份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度對(duì)照品70 %乙醇溶液25 ml，每一種濃度測(cè)定3份，按照 “2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷平均回收率分別為99.7 %，97.6 %，97.9 %；RSD分別為1.9 %，1.4 %，1.3 %，結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取大黃蟄蟲(chóng)片按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，于0，3，6，15，20，24 h分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定其芍藥苷、甘草苷、黃芩苷峰面積，芍藥苷、甘草苷及黃芩苷峰面積的RSD分別為1.1 %，1.2 %，1.7 % 。結(jié)果表明，供試品溶液24 h穩(wěn)定性良好，

2.9 樣品測(cè)定

取10批大黃蟄蟲(chóng)片，按照“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積結(jié)果，并根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

由于該系統(tǒng)需要同時(shí)檢測(cè)的3種成分，無(wú)法用等度洗脫的方式，只能通過(guò)改變流動(dòng)相中水相以及有機(jī)相的比例隨時(shí)間的變化規(guī)律，使3種成分達(dá)到分離。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較多種不同流動(dòng)相及梯度洗脫程序下各成分的分離度及峰形，最終確定該流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（200～500 nm），分析3種化合物的紫外光譜，并綜合考慮檢測(cè)時(shí)3個(gè)色譜峰的響應(yīng)，及遇到各個(gè)影響因素，結(jié)果表明，3種化合物（芍藥苷、甘草苷及黃芩苷）在檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm 時(shí)，分離成分的效果良好。最終選擇230 nm 為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 耐用性實(shí)驗(yàn)

為使本方法在應(yīng)用中能不受設(shè)備、色譜柱及其他條件變化的限制，研究中在多條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證使用Boston C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；資生堂C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Acclaim 120A（4.6 mm×250 mm，5 μm）C18色譜柱；安捷倫1260、島津20AT、Waters2695高效液相色譜儀及柱溫、流動(dòng)相pH、流動(dòng)相比例微小變化項(xiàng)的耐用性考察。結(jié)果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷的定性重復(fù)性與定量重復(fù)性偏差RSD均在2 %以?xún)?nèi)，各條件下色譜峰均分離效果較好，測(cè)定最終的結(jié)果基本保持了一致，表明方法耐用性較好。