左庚亮，馬喆

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

沙門菌是一類重要的食源性病原微生物，該病原血清型眾多，能夠?qū)е履c熱、食物中毒及急性敗血癥等多種疾病，給公共衛(wèi)生和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成重大危害[1]。歐盟最新研究報告指出，有1/5的食源性疾病由沙門菌感染引起，將近一半的成員國仍飽受沙門菌的困擾[2]。我國畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中沙門菌的污染情況嚴(yán)重，在“限抗令”背景下，愈發(fā)成為危害餐桌和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重大隱患，迫切需要開發(fā)針對不同血清型沙門菌的疫苗和非抗生素類藥物等產(chǎn)品，為沙門菌的防控和凈化工作助力，而建立可用于評價抗沙門菌疫苗和藥物效果的動物模型是實驗室產(chǎn)品試制階段的關(guān)鍵性基礎(chǔ)工作。

不同血清型的沙門菌對宿主的適應(yīng)性有所不同，適宜的動物模型是研究沙門菌生理功能、發(fā)病機(jī)制和病理損傷的關(guān)鍵。研究人員已經(jīng)建立了包括小鼠、雛雞、果蠅和斑馬魚等多種模型[3-6]。其中小鼠由于與人類基因同源性較高、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高和遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)勢，被廣泛用于沙門菌致病機(jī)制的相關(guān)研究[7]。小鼠腸道感染模型確立的過程中受到諸多因素如小鼠品系、細(xì)菌的血清型、菌株毒力和攻毒途徑等影響，直觀體現(xiàn)在小鼠對細(xì)菌感染劑量響應(yīng)上的差異[8]。以6周齡BALB/c小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，鼠傷寒沙門菌ATCC14028灌胃攻毒后,測得半數(shù)致死量為1.4×105CFU[9]。然而以昆明鼠為實驗?zāi)Ｐ停谇还辔甘髠抽T菌STM50115，半數(shù)致死量為4×108CFU；相同品系小鼠下，以鼠傷寒沙門菌SL1344進(jìn)行口腔攻毒，測得半數(shù)致死劑量為2.3×104CFU[10-11]。由此可見，已建立的小鼠模型僅適用于特定血清型的沙門菌，在研究沙門菌感染機(jī)制時應(yīng)結(jié)合實際情況，建立滿足自身實驗需求的小鼠感染模型。

本研究旨在分別用臨床分離的動物源雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌腹腔感染ICR小鼠，根據(jù)不同劑量感染下小鼠的存活曲線，組織細(xì)菌載量和組織病理學(xué)變化來評價沙門菌對小鼠的致病性，以便建立我國臨床常見的畜禽源不同血清型沙門菌株感染ICR小鼠模型，為研究沙門菌發(fā)病機(jī)制和沙門菌疫苗及藥物的開發(fā)提供動物模型基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞白痢沙門菌CVCC1800購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，鼠傷寒沙門菌CVCC542和腸炎沙門菌ATCC19585購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，SPF級4～6周齡ICR雌鼠購自南京青龍山動物繁殖場。

1.2 沙門菌最適感染劑量的確定

3株不同血清型的沙門菌平板劃線后置于溫箱中過夜培養(yǎng)。次日用接種環(huán)刮取平板上的全部菌落，分別接種到含有50 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6。菌體離心后用無菌的PBS洗滌重懸3次，根據(jù)表1的試驗方案將菌液調(diào)整至合適的稀釋度。將4～6周齡ICR雌鼠隨機(jī)分組，每組3只。攻毒后給予充足的水和飼料，每天觀察小鼠的生存狀況并繪制存活曲線。

表1 3株不同血清型沙門菌的小鼠攻毒模型確立方案

1.3 沙門菌感染小鼠后臟器的細(xì)菌載量檢測

小鼠感染沙門菌20 h后全部處死。剖檢后摘除脾臟、肝臟、空腸、回腸和盲腸部位以檢測細(xì)菌載量。腸道部分的摘取如圖1所示。

圖1 小鼠腸道部分摘取

向2 mL的滅菌勻漿管(含鋼珠)中加入1 mL的PBS緩沖液，擰好蓋子后稱重，記作管的初始重量。將摘取的小鼠臟器置于勻漿管中，擰好蓋子再次稱重。2次稱重的數(shù)值相減，即為待檢組織的重量。將勻漿管放入組織勻漿儀中，勻漿結(jié)束后置于4 ℃冰箱中備用。

96孔板每孔中加入180 μL的PBS緩沖液，取出勻漿管在渦旋儀上振蕩10 s后，擰開蓋子吸取20 μL進(jìn)行10倍比稀釋，稀釋度依次記為10-1～10-6，并進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.4 沙門菌感染小鼠后臟器的組織病理學(xué)變化

分別用不同血清型的沙門菌對小鼠進(jìn)行攻毒，攻毒20 h后處死。摘取脾臟、肝臟、空腸和回腸等部位，浸泡于10%的福爾馬林中固定。樣品由武漢賽維爾生物科技有限公司制作病理學(xué)組織切片。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌最適感染劑量的確定

攻毒后每隔12 h觀察小鼠狀態(tài)及存活情況(圖2)。各組小鼠均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡、被毛粗亂等臨床癥狀。對于雞白痢沙門菌，當(dāng)攻毒劑量為5.6×108CFU及以上時，組內(nèi)所有小鼠在48 h內(nèi)陸續(xù)死亡；當(dāng)攻毒劑量為5.6×107CFU時，2只小鼠在108 h內(nèi)陸續(xù)死亡，剩余1只小鼠耐過后康復(fù)；當(dāng)攻毒劑量低于5.6×107CFU時，組內(nèi)小鼠無死亡現(xiàn)象。對于腸炎沙門菌，當(dāng)攻毒劑量為3.2×108CFU及以上時，組內(nèi)小鼠在24 h內(nèi)陸續(xù)全部死亡；當(dāng)攻毒劑量為3.2×107CFU時，組內(nèi)小鼠在156 h內(nèi)陸續(xù)死亡；當(dāng)攻毒劑量低于3.2×107CFU時，組內(nèi)小鼠無死亡現(xiàn)象。對于鼠傷寒沙門菌，當(dāng)攻毒劑量為2.5×106CFU時，組內(nèi)小鼠在72 h內(nèi)陸續(xù)全部死亡；當(dāng)攻毒劑量為2.5×105CFU時，組內(nèi)小鼠在96 h內(nèi)陸續(xù)死亡；當(dāng)攻毒劑量為2.5×104CFU時，組內(nèi)小鼠無死亡。由此可知，雞白痢沙門菌CVCC1800、腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542對小鼠的最適感染劑量分別為5.6×108、3.2×107和2.5×106CFU。在最適感染劑量下，小鼠無急性死亡的情況發(fā)生，有充足的時間觀察小鼠的狀態(tài)，適合疫苗和藥物的臨床效果評估。

A、B、C對應(yīng)的沙門菌血清型依次為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌

2.2 沙門菌感染小鼠后臟器的細(xì)菌載量檢測

3株沙門菌感染小鼠的部位及感染量略有差異(圖3)。雞白痢沙門菌主要感染小鼠的腸道部分，空腸的細(xì)菌載量約為2.7×108CFU/g，回腸細(xì)菌載量約為6.7×108CFU/g,顯著高于脾臟和肝臟的細(xì)菌載量約104CFU/g。腸炎沙門菌感染小鼠的部位較為廣泛，脾臟載量高于其他臟器，約為7.4×107CFU/g。肝臟細(xì)菌載量約為4.9×106CFU/g，腸道部位的細(xì)菌載量區(qū)間在106～107CFU/g。鼠傷寒沙門菌在小鼠的各臟器均有分布，但細(xì)菌載量差異不顯著。

A、B、C對應(yīng)的沙門菌血清型依次為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌

2.3 沙門菌感染小鼠后臟器的組織病理學(xué)變化

雞白痢沙門菌CVCC1800感染小鼠后，空腸黏膜層結(jié)構(gòu)輕微受損，部分腸絨毛斷裂(圖4A)；回腸受損嚴(yán)重，黏膜層細(xì)胞大量壞死脫落，無法辨別正常結(jié)構(gòu)(圖4B)。腸炎沙門菌ATCC19585感染小鼠后，脾臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(圖4C)，肝臟組織出現(xiàn)大量空泡病變(圖4D)。鼠傷寒沙門菌CVCC542感染小鼠后，脾臟也出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象(圖4E)，肝臟組織中部分肝細(xì)胞固縮，且肝索走向不明顯(圖4F)。

A和B分別為小鼠感染雞白痢沙門菌CVCC1800的空腸和回腸組織病變(100×)；C和D分別為小鼠感染腸炎沙門菌ATCC19585的脾臟和肝臟組織病變(400×)；E和F分別為小鼠感染鼠傷寒沙門菌CVCC542的脾臟和肝臟組織病變(400×)

3 討論

小鼠由于遺傳背景清晰及成本低廉而被廣泛用于沙門菌的相關(guān)研究。針對不同來源沙門菌，根據(jù)研究的對象和目的不同，應(yīng)該重新評判小鼠模型在評價沙門菌感染情況時的適用性。王偉等[8]將不同劑量的腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SE50336通過口腔灌注的方式感染6周齡ICR雌鼠，最終測定半數(shù)致死量LD50為1×104.67CFU；姚營等[12]以昆明小鼠為模型，用鼠傷寒沙門菌灌胃攻毒，通過觀察攻毒后小鼠的腸道組織病變，小腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和腸道淋巴細(xì)胞增殖狀況，初步探索了鼠傷寒沙門菌引發(fā)腸炎的發(fā)病機(jī)制和病理生理。而本研究將腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542腹腔接種到ICR雌鼠體內(nèi)，測得其最適感染劑量分別為3.2×107CFU和2.5×106CFU，感染后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、采食減少及不愿活動等癥狀，脾臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝臟組織出現(xiàn)大量空泡病變。這與上述動物模型感染劑量和病理變化上略有差異，差異可能與小鼠品系和菌株毒力有關(guān)。

雞白痢沙門菌具有高度的宿主專嗜性，主要感染雞和火雞。因此特定品系的SPF雞如白來航雞(White Leghorns)、羅德島紅雞(Rhode Island Red)和溫多特雞(White Wyandottes)等來被用于雞白痢沙門菌的研究[13-14]。本研究用雞白痢沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC1800腹腔感染小鼠，測得最適感染劑量為5.6×108CFU，這也是將ICR小鼠作為雞白痢沙門菌的模式動物的首次嘗試。相較于腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌引起的雞局部感染或腸炎癥狀，雞白痢沙門菌可引起全身性感染[15]。但從本試驗獲得的細(xì)菌載量上看，雞白痢沙門菌主要感染小鼠的空腸和回腸，其次為盲腸。脾臟和肝臟中細(xì)菌載量較低，與感染劑量相比，細(xì)菌在小鼠肝臟脾臟中的定殖效果并不理想。

本研究建立了雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的ICR小鼠腹腔感染模型，其中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌小鼠感染模型效果較好，雞白痢沙門菌由于宿主嗜性差異，在小鼠臟器中的定殖效果并不理想。本研究建立的小鼠模型為探究這3株不同血清型畜禽源分離沙門菌的致病機(jī)制提供模型參考，并為抗沙門菌疫苗和藥物的評價奠定基礎(chǔ)。