胡 爽，辛傳偉，羊 波，夏仲尼

(浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310012)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease.，DKD)是糖尿病患者常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥。研究表明，DKD占終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的30%～47%，是引起終末期腎病的最常見誘因[1-2]，其發(fā)病機(jī)理和防治途徑是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，MC)是腎小球內(nèi)的固有細(xì)胞，在各種病理因素作用下，MC凋亡造成的系膜細(xì)胞缺失是糖尿病腎損傷的重要機(jī)制[3]。因此，研究尋找抑制MC凋亡的有效藥物，具有重要的意義。消渴平合劑(Xiaokeping，XKP)作為醫(yī)院制劑，前期研究表明該藥有改善胰島素抵抗、保護(hù)大鼠腎功能等作用[4-5]；但尚未見消渴平對(duì)MC凋亡的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察消渴平對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響，探討其防治 DKD的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1：購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥物與試劑 消渴平(黃芪、生地黃、丹參、山藥、菊花、麥冬、天花粉、枸杞子等配方組成)：浙江省中醫(yī)藥研究院制劑室生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基：Hyclone；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；TUNEL凋亡試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗 cleaved caspase-3：美國(guó) Cell Signaling；兔抗 Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素 C (Cytochrome c，Cyt-C)抗體：英國(guó) Abcam。

1.3 血清制備 取SPF級(jí)雄性健康SD大鼠40 只，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0015，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用指南飼養(yǎng)。含藥血清分別使用消渴平高濃度(2 g·mL-1)、低濃度(0.5 g·mL-1)的濃縮液對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃。正常對(duì)照組則給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥后2 h無(wú)菌操作心臟采血，分離血清，置于-20 ℃冷存?zhèn)溆?。使用前置?6 ℃的水浴行30 min滅活，然后 0.2 μm微孔濾膜除菌備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 取第5代大鼠系膜細(xì)胞，用含15%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，接種于96 孔板中，貼壁同步化24 h，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如下：正常對(duì)照組(加入10%正常大鼠血清，NC組)、高糖組(25 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)，HG組)、正常血清+高糖組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%正常大鼠血清，NS組)、消渴平低劑量組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%XKP 0.5 g·mL-1含藥血清，LXKP組)、消渴平高劑量組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%XKP 2 g·mL-1含藥血清，HXKP組)、厄貝沙坦組(25 mmol·L-1葡萄糖+10%厄貝沙坦3 g·L-1含藥血清，IP組)。

1.5 觀察指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 系膜細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按照生工生物工程TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，首先細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后加藥。藥物作用結(jié)束棄去培養(yǎng)液，每孔加入1～2 mL預(yù)冷的4%多聚甲醛，固定10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；通透細(xì)胞膜后，滴加Tunel工作液100 μL行Tunel反應(yīng)，PBS漂洗后，每孔加入核染試劑DAPI細(xì)胞核染色，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，以陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算凋亡率(AI)。

1.5.2 Western blot檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C的蛋白表達(dá) 分別添加RIPA 蛋白裂解液60 μL、蛋白酶抑制劑0.6 μL，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。分別用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)蛋白樣品分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，然后加二抗2 h室溫孵育，滴加ECL后檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參照，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各目的條帶灰度值。

1.5.3 熒光定量PCR檢測(cè)腎小球系膜細(xì)胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況 收集細(xì)胞樣品，加入Trizol試劑，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，引物設(shè)計(jì)如表1所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

表1 熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果

2.1 消渴平對(duì)各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，高糖組大鼠腎小球系膜細(xì)胞中凋亡率顯著升高(P<0.01)。與高糖組相比，正常血清+高糖組大鼠腎小球系膜細(xì)胞中凋亡率無(wú)顯著性變化，消渴平高劑量治療組及IP治療組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組腎小球系膜細(xì)胞的凋亡變化(×400)

表2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡率比較

2.2 消渴平對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC組相比，高糖組cleaved Caspase-3、Bax、Cyt-C蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與高糖組比較，HXKP及IP組cleaved Caspase-3、Bax、Cyt-C表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，其中消渴平高劑量組與IP組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見圖2，表3。

圖2 各組腎小球系膜細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達(dá)Western blot 檢測(cè)結(jié)果

表3 各組腎小球系膜細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及Cyt-C蛋白表達(dá)的比較

2.3 消渴平對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，高糖組Bax mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與高糖組比較，HXKP及IP治療組Bax mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。其中HXKP組與IP治療組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見表4。

表4 各組腎小球系膜細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)的比較

3 討論

糖尿病腎病(DKD)發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，研究表明，糖尿病腎病腎臟損傷從腎小球系膜細(xì)胞凋亡開始，致使腎小球基底膜增厚，誘發(fā)腎衰竭，干預(yù)腎小球系膜細(xì)胞的凋亡能夠有效減少DKD腎損傷[6]。本研究利用體外高糖對(duì)系膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，TUNEL研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞在高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)環(huán)境下明顯出現(xiàn)凋亡；與高糖組相比，消渴平高劑量組能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，消渴平高劑量組能明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax及Cyt-C的蛋白表達(dá)(P<0.05)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)；熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)消渴平對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡具有抑制作用，可顯著降低Bax mRNA表達(dá)(P<0.05)，明顯升高Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。

研究表明，B淋巴細(xì)胞瘤基因相關(guān)X蛋白(Bax)主要作用在線粒體水平，其與B淋巴細(xì)胞瘤基因-2(Bcl-2)屬于一個(gè)家族，通過控制線粒體膜的通透性來(lái)阻止Cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。半胱天冬酶-3(Caspase-3)是參與細(xì)胞凋亡過程中的信號(hào)分子，它的活化可以被Bcl-2阻斷，從而產(chǎn)生抑制凋亡的作用[8]。生理狀態(tài)下Bax/Bcl-2保持相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡，在疾病狀態(tài)下，Bax介導(dǎo)Cyt-C的釋放，具有促凋亡作用，而Bcl-2可阻止凋亡形成因子Cyt-C從線粒體釋放出來(lái)，具有抗凋亡作用[9]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高糖刺激下系膜細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cyt-C、cleaved caspase-3表達(dá)增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而消渴平高劑量組能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。

消渴平合劑為筆者所在醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期臨床研究表明該藥可提高胰島素敏感性[4]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)消渴平合劑可以明顯降低db/db小鼠體質(zhì)量及血肌酐、尿素氮水平[10]。本實(shí)驗(yàn)從系膜細(xì)胞凋亡的角度探討了消渴平合劑對(duì)DKD的防治機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消渴平合劑可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞凋亡，明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax及Cyt-C蛋白表達(dá)，升高Bcl-2 蛋白表達(dá)，這可能是其防治DKD的機(jī)制之一。