不同海藻肥栽培料對(duì)平菇酶活力的影響

顏佳雯，朱長俊，王浩然，仵培，張琳，秦益民

（1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海藻類肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400；3.海藻活性物質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400）

傳統(tǒng)的平菇栽培料通常以棉籽殼為主，但其運(yùn)輸成本較高，需找到其替代品以降低栽培成本。隨著海藻工業(yè)的發(fā)展，越來越多的海藻渣被作為工業(yè)廢渣排放至水中，與水形成膠性粘稠物，造成水體污染[2]。研究發(fā)現(xiàn)，海藻渣中含有較多營養(yǎng)成分，可用于平菇菌等食用菌的栽培，當(dāng)海藻渣和棉籽殼比例為1 ∶1時(shí)，平菇菌絲蔓延速度最快，子實(shí)體多糖含量高達(dá)14.84%[3]。海藻渣還可以進(jìn)一步提煉濃縮制成海藻肥，比化學(xué)肥料更能提高植物的光合作用，促進(jìn)作物增產(chǎn)和早熟，提高抗逆能力，且綠色無公害，從而改善作物的品質(zhì)[4-5]。目前，已有研究采用海藻肥培育火龍果、草莓、菠菜等[6-8]，但在栽培食用菌上還未得以應(yīng)用。本研究用不同種類及不同濃度的海藻肥栽培平菇并對(duì)其酶活力進(jìn)行測定，以找到最優(yōu)配比為海藻渣的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為高平58（Pleurotusostreatus），本實(shí)驗(yàn)室保存；原料型、配合型、控釋型、有機(jī)型和平衡型5 種海藻肥由青島明月公司提供。

1.2 儀器與試劑

UV-1100 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA1243 電子分析天平，上海昔今實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Eppendorf5810R 離心機(jī)，迪圖（上海）生物科技有限公司。

無水乙醇，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、DNS 顯色劑、Tris 試劑，Scientific Phygene；30% H2O2，上海遠(yuǎn)大過氧化物有限公司。

1.3 配置培養(yǎng)基

如表1所示，為栽培料中海藻肥及棉籽殼的用量，此外，添加麥麩20 g、蔗糖1 g、氧化鈣1 g。

表1 栽培料配比表

1.4 獲取子實(shí)體

按表1 配方，配制8 種栽培料，濕度合適，pH 調(diào)至7。發(fā)酵24 h 后每種栽培料分裝10 瓶，121 ℃滅菌2 h。菌餅法接種，置28 ℃培養(yǎng)，平菇長至八成熟時(shí)采收[9]。

1.5 酶活力測定

1.5.1 粗酶液制備

稱取A 組新鮮子實(shí)體2 g 研磨，加入25 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.6），85 00 r/min 離心15 min，上清液作為酶提取液。其余各組依次重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，獲得粗酶液。

1.5.2 過氧化氫酶

取8 支試管，各加0.1 mL 粗酶液，用相同條件下沸水浴10 min 滅活的粗酶液作對(duì)照。每支試管中加1.7 mL 蒸餾水、1.0 mL Tris-HCl 緩沖液，25 ℃水浴20 min 后，加0.2 mL 0.1 mol/LH2O2。每加完一管后立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm 下測吸光度，每隔1min 讀數(shù)1 次，測3 次[10-11]。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在上述試驗(yàn)條件下，每分鐘引起OD 值改變0.1 所需的酶量。計(jì)算公式如式（1）所示。

式（1）中：t為反應(yīng)時(shí)間；c為樣品粗酶提取液體積與反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)粗酶提取液體積之比。

1.5.3 纖維素酶

取8 支試管，分別加入粗酶液1.0 mL，加入1%CMC-Na 溶液1.0 mL，50 ℃水浴30 min，加入2.0 mL DNS 試劑，沸水浴10 min，立即冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。8 組粗酶液相互對(duì)照，測定540nm 處吸光度值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量，根據(jù)公式（2）計(jì)算酶活[12]。酶活定義為：1.0 mL 酶液1.0 min 催化纖維素生成1.0μmol 葡萄糖為1 個(gè)酶活單位，以U/mL 表示，

式（2）中，N表示粗酶液的稀釋倍數(shù)；5.56 為還原糖的摩爾系數(shù)；A表示由吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度；V表示酶解反應(yīng)之后試管內(nèi)溶液體積；T表示反應(yīng)時(shí)間；V1表示所加酶液體積。

1.5.4 淀粉酶

取8 支試管，分別取2 mL 的粗酶液于試管中，再分別加入1 mL DNS 試劑后至40 ℃的水浴中5 min，定容至25 mL，在520 nm 波長下測吸光度。定義以1 mL 的粗酶液中的淀粉酶，在40 ℃溫度下1 min 生成0.1 mg 的還原糖為1 個(gè)活力單位（U）。計(jì)算公式如式（3）所示。

式（3）中，C為測定的還原糖產(chǎn)量，7 為定值，2 為加入的粗酶液，0.1 為1 min 生產(chǎn)0.1 mg 的還原糖，5 為水浴時(shí)間。

1.5.5 漆酶

取9 支試管，分別移取1 mL 粗酶液置試管中，其中一支試管通過沸水浴滅活，作為對(duì)照。反應(yīng)體系為1 mL 粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L 的ABTS 緩沖液，反應(yīng)3 min，分光光度計(jì)在410 nm波長處測OD值。定義每分鐘使OD 均值增加0.1 所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U），用公式（4）計(jì)算漆酶活力。

式（4）中：A為3 min 吸光度；t為反應(yīng)時(shí)間的變化量，min；V1為反應(yīng)總體積，mL；V2為測定酶活力時(shí)所取的酶液體積，mL；ε為3.6×104mol/(L·cm)；N為酶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻肥用量對(duì)平菇子實(shí)體酶活的影響

8 個(gè)栽培組4 種酶活測定結(jié)果如圖1 所示：對(duì)比使用同一濃度的海藻肥栽培組可得出，A 組和D組使用的海藻肥其測得的過氧化氫酶、纖維素酶活力高于空白組測得的結(jié)果，其中D 組比空白組H 過氧化氫酶活力提高了24.26%，纖維素酶活力提高了22.35%，但E、G 組測得的過氧化氫酶活力明顯低于空白組，即起到了一定的抑制作用，其中E 組的抑制作用最明顯，過氧化氫酶活力低了21.2%，纖維素酶活力低了21.97%，A 組和F 組使用的海藻肥其測得的漆酶活力高于空白組測得的漆酶活力，其中A 組比空白組H 漆酶活力提高了38.43%，但D、E、F 組測得的漆酶活力明顯低于空白組即起一定的抑制作用，其中D 組的抑制作用最明顯，酶活力低了28.59%。

圖1 原料型海藻肥用量對(duì)平菇子實(shí)體酶活的影響

2.2 海藻肥類型對(duì)平菇子實(shí)體酶活的影響

將原料型海藻肥實(shí)驗(yàn)組按添加量不同分為A、B、C 組，其中B 組測得的過氧化氫酶活力比空白組提高了18.62%，纖維素酶活力比空白組提高了15.36%，漆酶活力比空白組提高了69.95%，可推斷出100 g 栽培料中加入的原料型海藻肥高于10 g 可能會(huì)對(duì)過氧化氫酶、纖維素酶和漆酶活力均起抑制作用。對(duì)于淀粉酶活力而言，本次使用的海藻肥對(duì)淀粉酶活力均起抑制作用。

圖1 海藻肥類型對(duì)平菇子實(shí)體酶活的影響

3 結(jié)論

海藻肥用量及海藻肥種類對(duì)平菇子實(shí)體的酶活力均有影響：控釋型和平衡型海藻肥不適合用來提高平菇酶活力即平菇的生長能力，原料型和配合型則較適合添加在平菇栽培料中，后續(xù)可繼續(xù)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)深入測定；不同濃度海藻肥對(duì)平菇內(nèi)的酶活力影響有一定差異，以原料型海藻肥為例，100 g 栽培料中添加10 g 海藻肥時(shí)平菇酶活力最強(qiáng)，100 g 栽培料中添加高于15 g 海藻肥則會(huì)對(duì)平菇酶活力起一定的抑制作用。