賈小霞，齊恩芳，劉 石，黃 偉，呂和平，文國宏，馬 勝

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所，蘭州730070；2甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實驗室，蘭州730070；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北旱作馬鈴薯科學觀測實驗站，甘肅渭源748201）

0 引言

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進，馬鈴薯種植面積日益增加[1]。然而，在馬鈴薯生產(chǎn)中，病毒病的普遍發(fā)生導致馬鈴薯的產(chǎn)量降低和商品性狀退化，而且隨著種植年限的增加逐年加重，嚴重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展[2-3]。馬鈴薯脫毒種薯的繁育和推廣可以從根本上抑制病毒病的發(fā)生和蔓延，是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要保障[4-5]，脫毒試管苗的擴繁是脫毒種薯繁育的一個重要環(huán)節(jié)[6-7]，培養(yǎng)基是脫毒試管苗生產(chǎn)的基礎(chǔ)[8]。目前，馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)試管苗快繁大多采用MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分是影響試管苗生長的重要因素，不同品種對營養(yǎng)元素的需求也有差異[9]?！M烏瑞它’較適應含高氮、磷、鉀的MS培養(yǎng)基，‘中薯3號’較適應常規(guī)含量的MS培養(yǎng)基[10]，‘新大坪’在含9 mmol/L氯化鈣的MS培養(yǎng)基上生長狀態(tài)最佳[11]，‘克新13號’和‘克新1號’在僅含大量元素的MS培養(yǎng)基上葉大色綠，株高和莖粗均與常規(guī)培養(yǎng)基上的脫毒苗無顯著差異[12]，生長在缺P培養(yǎng)基上的‘鄂馬鈴薯3號’脫毒苗的植株生長形態(tài)、生物產(chǎn)量均較缺N高[13]。在保證高質(zhì)量的前提下，降低成本有利于脫毒種苗與種薯的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，不添加有機物（包括肌醇）的MS培養(yǎng)基與全量添加的MS培養(yǎng)基上生長的試管苗的農(nóng)藝性狀基本一致[14]，本課題組的長期生產(chǎn)試驗也證實了這一觀點，為了節(jié)省成本，生產(chǎn)中大都用不添加有機物的MS培養(yǎng)基替代全量添加的MS培養(yǎng)基?？梢钥闯?，為了節(jié)省成本和簡化試驗，前人做了大量研究，但不同品種對營養(yǎng)元素的需求存在較大差異?！]薯7號’因為其抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、廣適的特點，被農(nóng)業(yè)部確定為2014年主導品種，不僅在甘肅省每年種植面積超過13.33萬hm2，在陜西、寧夏和青海等其他西北地區(qū)也有大面積種植[15]，近幾年在廣東、廣西、福建等南方冬作區(qū)也有較大面積的種植[16]?！]薯20號’是具有抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等特性的早熟新品種，具有很好的應用前景，篩選這2個品種脫毒苗快繁的最佳培養(yǎng)基，是滿足全國脫毒種薯全覆蓋的重要基礎(chǔ)，但關(guān)于這2個品種培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗目前尚未見報道。因此，本研究以‘隴薯7號’和‘隴薯20號’脫毒試管苗為試驗材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究缺鈣、鐵和微量元素對試管苗生長的影響，旨在篩選‘隴薯7號’和‘隴薯20號’脫毒苗高效低成本快繁培養(yǎng)基的同時，為馬鈴薯脫毒苗快繁生產(chǎn)中培養(yǎng)基的進一步優(yōu)化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料馬鈴薯栽培品種‘隴薯7號’和‘隴薯20號’，為甘肅省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室繼代培養(yǎng)的脫毒苗，每25～30天在MS培養(yǎng)基上繼代繁殖1次，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強度為2000～2500 lx，光照周期為16 h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 分別設含MS培養(yǎng)基不同成分的培養(yǎng)基8組，培養(yǎng)基成分見表1。所有處理均添加4.5 g/L瓊脂，30 g/L白糖，調(diào)節(jié)pH 5.8～6.0。在無菌條件下，選取生長健壯的馬鈴薯試管苗，切成帶1個腋芽的莖段，接種到上述8種培養(yǎng)基中，每瓶接10株，每個處理12瓶，3次重復。接種后將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)室，在23±2℃、光照周期為16 h/d的條件下培養(yǎng)，第30天時，進行相關(guān)指標的測定。試驗于2020年2—8月份在甘肅省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所組織培養(yǎng)室進行。

表1 培養(yǎng)基

1.2.2 測定項目 試管苗培養(yǎng)30天時進行取樣調(diào)查，每個處理隨機抽取3瓶，測定株高(cm)、活葉數(shù)（片/株）、莖粗(mm)、植株鮮重(mg/株)、植株干重(mg/株)。采用直尺測量植株株高（植株莖基部到生長點的高度，cm）；采用數(shù)顯游標卡尺測量莖基部的直徑即為莖粗(mm)、根莖葉干重(mg)采用烘干法測定，即測完鮮重(mg)后，于105℃殺青30 min后，80℃烘干至恒重。

葉綠素含量的測定：取新鮮的試管苗0.25 g，加入少量CaCO3和石英砂，加入1 mL 80%的丙酮研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，再用5～8 mL 80%的丙酮洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管，在避光環(huán)境下靜置數(shù)小時，待組織變白后進行離心，離心后棄沉淀，上清液用80%的丙酮定容到10 mL后，使用UV-5800型紫外分光光度計測定663 nm和645 nm處的OD值，以80%的丙酮調(diào)零。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理采用Microsoft Excel 2010；單因素方差(One-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計分析采用DPS V3.01軟件；差異顯著性采用Duncan’s法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺微量元素對試管苗生長的影響

與1號相比，2號培養(yǎng)基缺微量元素。接種13天時，兩品種在1號和2號培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長正常；培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異（表2和圖3）；‘隴薯20號’的莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異，但1號培養(yǎng)基上試管苗的株高顯著高于2號（表3和圖3）。

表2 MS培養(yǎng)基不同成分對‘隴薯7號’試管苗生長的影響

表3 MS培養(yǎng)基不同成分對‘隴薯20號’試管苗生長的影響

2.2 缺鐵對試管苗生長的影響

與1號相比，3號培養(yǎng)基缺鐵。接種13天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，3號培養(yǎng)基上的試管苗雖發(fā)出新芽，但葉片白化，植株生長受阻（圖1 A）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常（圖2 A）。培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長正常，而3號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1 B）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長正常，且株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異（表3和圖3）。

圖1 ‘隴薯7號’試管苗

圖2 ‘隴薯20號’試管苗

2.3 缺鈣對試管苗生長的影響

與1號相比，4號培養(yǎng)基缺鈣。接種13天時，2個品種在1號和4號培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時，2個品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常。‘隴薯7號’植株的莖粗和葉片數(shù)在各處理間無顯著差異，而4號培養(yǎng)基上的試管苗株高、莖葉鮮干重均顯著高于1號（表2），葉綠素含量顯著低于1號（圖3）；‘隴薯20號’植株的莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異，1號培養(yǎng)基上的試管苗株高顯著高于4號（表3），但4號培養(yǎng)基上的試管苗葉綠素含量顯著高于1號（圖3）。

2.4 同時缺乏微量元素和鐵鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，5號培養(yǎng)基同時缺乏微量和鐵鹽。接種13天時，‘隴薯7號’在5號培養(yǎng)基上的試管苗株高稍低于1號，但葉色濃綠、植株生長正常；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上都葉色濃綠、植株生長正常。培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’除株高和葉綠素含量在兩處理間無顯著差異外（表2、圖3），5號培養(yǎng)基上試管苗的莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重均高于1號（表2）；‘隴薯20號’植株的株高在5號培養(yǎng)基上顯著低于1號，葉綠素含量顯著高于1號，莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異（表3、圖3）。

2.5 同時缺乏微量和鈣鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，6號培養(yǎng)基同時缺乏微量和鈣鹽。接種13天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常，但6號培養(yǎng)基上的株高略低于1號（圖1A和圖2A）。培養(yǎng)30天時，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長正常?！]薯7號’在6號培養(yǎng)基上的株高顯著低于對照，莖粗顯著高于1號，葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量與1號無顯著差異（表2和圖2）；‘隴薯20號’在6號培養(yǎng)基上的株高和葉綠素含量分別顯著低于和高于1號（表3和圖3），但莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重在兩處理間無顯著差異（表3）。

圖3 MS培養(yǎng)基不同成分對試管苗葉綠素含量的影響

2.6 同時缺乏鐵鹽和鈣鹽對試管苗生長的影響

與1號相比，7號培養(yǎng)基同時缺乏鐵鹽和鈣鹽。接種13天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，7號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，莖葉發(fā)黃，植株生長緩慢；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’在1號培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長正常，而7號培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1B）；‘隴薯20號’在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長正常，7號培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于1號（表3和圖3）。

2.7 試管苗在只含MS大量元素培養(yǎng)基上的生長情況

與1號相比，8號培養(yǎng)基只含MS大量元素。接種13天時，2個品種在1號培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長正常，在8號培養(yǎng)基上的試管苗莖葉微黃；培養(yǎng)30天時，2個品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長正常，‘隴薯7號’在8號培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖葉干重和葉綠素含量高于1號培養(yǎng)基，但未達到顯著水平，而莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮重均顯著高于1號（表2、圖3）?！]薯20號’在8號培養(yǎng)基上的葉綠素含量顯著高于1號（圖3），株高、莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重與1號無顯著差異（表3）。

3 討論與結(jié)論

MS培養(yǎng)基是馬鈴薯組織培養(yǎng)中最為常用的基本培養(yǎng)基之一[17]，培養(yǎng)基的成分主要包括大量元素(KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4)、鈣鹽(CaCl·2H2O)、微量元素(MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CoCL2·6H2O、CuSO4·5H2O)、鐵鹽(Na2EDTA、FeSO4·7H2O)、有機（煙酸、VB6、VB6和甘氨酸）和肌醇。培養(yǎng)基成分直接影響試管苗的生長[18]。鐵是葉綠素形成不可缺少的元素，在植株體內(nèi)很難轉(zhuǎn)移，鐵元素的缺乏會改變?nèi)~綠素的合成，使植物葉片黃化，表現(xiàn)為“失綠癥”[19]。本研究中，2個參試品種（‘隴薯7號’和‘隴薯20號’）對鐵元素缺乏的反應不一樣。以除去有機的MS培養(yǎng)基為對照，接種在不添加鐵鹽培養(yǎng)基上的‘隴薯7號’試管苗莖葉白化，生長完全被抑制，這與陳永波[20]關(guān)于缺鐵抑制鄂馬鈴薯3號脫毒試管苗生長的研究結(jié)果一致；而‘隴薯20號’在不添加鐵鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，植株生長正常，且株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量與對照無顯著差異，這說明馬鈴薯不同品種對鐵元素的需求量有很大的差異。

鈣是植物生長發(fā)育必不可少的一種大量元素[21]，適量濃度的鈣對植物的生長是有益的，可增加植株鮮重、干物質(zhì)含量、根冠比和形成壯苗，植物缺鈣時，生長旺盛組織的生長會受到抑制，導致植株高度、葉片數(shù)量及生物產(chǎn)量下降[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種在不添加鈣鹽的培養(yǎng)基上時，2個品種都能正常生長，‘隴薯7號’試管苗除葉綠素含量低于對照外，株高、葉片數(shù)、莖葉鮮干重均顯著高于對照，這與杜強[11]等關(guān)于缺鈣導致馬鈴薯栽培品種‘新大坪’試管苗的株高、葉片數(shù)、莖葉和根鮮干重均顯著低于常規(guī)MS培養(yǎng)基上生長植株的結(jié)果不盡一致?！]薯20號’的株高顯著低于對照，這與杜強[11]等關(guān)于缺鈣不利于‘新大坪’試管苗生長的研究結(jié)果基本一致。這表明鈣元素對馬鈴薯試管苗的生長有促進作用，缺鈣對生長的影響因品種各異。有趣的是，‘隴薯20號’在同時缺乏鐵鹽和鈣鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對照，意味著鐵鹽和鈣鹽在‘隴薯20號’試管苗的生長過程中有相互協(xié)同作用，這還有待進一步研究。

微量元素在植物的生長發(fā)育中需求較少，但對植物的生長發(fā)育卻產(chǎn)生重要作用，特別是在植物的光合作用、呼吸作用、能量代謝等重要生理過程中起著至關(guān)重要的作用。陳永波[20]等采用不完全營養(yǎng)液法研究微量元素的缺乏與過量對脫毒馬鈴薯苗生長的影響時發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液中缺乏錳元素時，會表現(xiàn)出葉片較小，舒展不開，且出現(xiàn)卷曲，缺少Cu、Zn、Mo時無明顯癥狀表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，以除去有機的MS培養(yǎng)基為對照，全量省去微量元素對‘隴薯7號’沒有產(chǎn)生明顯的不利影響，試管苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量等各指標與對照無顯著差異，這與劉衛(wèi)平[12]以‘克新13號’和‘克新1號’為材料的研究結(jié)果一致?！]薯20號’在全量省去微量元素或同時省去鈣鹽和微量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，除株高顯著低于對照外，莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重與對照無顯著差異，這與陳永波[13]以‘鄂馬鈴薯3號’脫毒試管苗為研究對象時，缺乏微量元素導致植株葉片先出現(xiàn)褐色斑點直至最后形成爛葉的研究結(jié)果不同，這種不同可能來源于品種的差異；在只含MS大量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，‘隴薯7號’和‘隴薯20號’在前期均出現(xiàn)莖葉微黃的現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)時間的延長，微黃現(xiàn)象逐漸消失，培養(yǎng)30天時，‘隴薯7號’的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對照，‘隴薯20號’的各指標與對照無顯著差異。為了保證試管苗質(zhì)量，通過比較所設8種培養(yǎng)基上試管苗的生長指標，發(fā)現(xiàn)‘隴薯7號’和‘隴薯20號’分別可以在MS大量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖和MS大量元素+微量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖的培養(yǎng)基上高效快繁。

本研究只對‘隴薯7號’和‘隴薯20號’的快繁培養(yǎng)基進行了研究，但馬鈴薯不同品種對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的需求存在較大差異，為了達到高效低成本的快繁目的，在實際生產(chǎn)中應針對不同品種進行進一步優(yōu)化。與生產(chǎn)中普遍用常規(guī)MS全量培養(yǎng)基快繁試管苗相比，用只含大量元素的MS培養(yǎng)基快繁全國主導品種‘隴薯7號’脫毒試管苗，不僅操作簡單、而且大幅度降低了成本，為滿足國家馬鈴薯脫毒種薯全覆蓋的需求奠定了基礎(chǔ)。