李天峰，葉筱彤，雷 行，滿 欣，白素英，2*

（1.東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040；2.國(guó)家林業(yè)和草原局 野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱 150040）

雄性哺乳動(dòng)物的生殖腺包括睪丸和副腺（精囊腺和前列腺）。麝鼠（OndatrazibethicusLinnaeus）是一種小型毛皮動(dòng)物。雄性麝鼠的生殖腺隱于體內(nèi)，在腹腔下部。麝鼠的生殖腺會(huì)隨著麝鼠繁殖的進(jìn)行逐漸發(fā)育，在繁殖期后半程會(huì)逐漸萎縮，繁殖期結(jié)束后萎縮到最小。麝鼠睪丸在3月起開(kāi)始逐漸發(fā)育，5月體積達(dá)到最大，8月開(kāi)始逐漸萎縮，9月左右睪丸體積達(dá)到最小，約為最大體積的三分之一［1］。鮮義坤等［2］的研究證明了光周期與環(huán)境溫度是調(diào)控麝鼠睪丸發(fā)育的重要環(huán)境因素，而麝鼠生殖腺周期變化由哪些基因調(diào)控目前還未見(jiàn)報(bào)道。

生物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡與穩(wěn)定，不僅僅依賴于細(xì)胞的增殖與分化，也依賴于細(xì)胞的凋亡。凋亡并不僅僅是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，而且與生物體內(nèi)環(huán)境平衡、組織與器官發(fā)育、某些疾病的發(fā)生乃至細(xì)胞壞死等過(guò)程都有著密切的關(guān)系［3］。在細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程中，有非常多的因素在其中扮演重要角色。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由多條通路、多個(gè)基因共同調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，細(xì)胞受到刺激，響應(yīng)凋亡信號(hào)，Cytc、SMAC與AIF等促凋亡因子釋放到胞漿中，引發(fā)一系列精密的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡最終由Caspase家族基因執(zhí)行。Caspase家族蛋白酶以不活躍酶原存在，在受到凋亡刺激后執(zhí)行凋亡功能。Caspase蛋白酶分啟動(dòng)型與效應(yīng)型，啟動(dòng)型負(fù)責(zé)接受凋亡信號(hào)并激活效應(yīng)型Caspase蛋白酶，效應(yīng)型Caspase蛋白酶通過(guò)不同途徑促使細(xì)胞凋亡。

線粒體是一個(gè)含有雙層膜的細(xì)胞器，同時(shí)線粒體的外膜間隙中也含有各種促凋亡因子，如Cytc、AIF和SMAC等。因此，線粒體外膜的完整性對(duì)細(xì)胞凋亡具有非常重要的意義。在細(xì)胞響應(yīng)凋亡信號(hào)時(shí)，各種促凋亡因子從線粒體的膜間隙釋放到細(xì)胞的胞漿中，從而引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。Cytc釋放到胞漿后可以與Caspase-9蛋白、Apaf-1蛋白結(jié)合形成凋亡體，凋亡體是細(xì)胞凋亡時(shí)形成的重要結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)通過(guò)分析結(jié)合成為凋亡體三個(gè)基因的表達(dá)，為深入了解麝鼠生殖腺發(fā)育的規(guī)律以及這些基因在麝鼠生殖腺發(fā)育周期中起到的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2019年5月初，由黑龍江省哈爾濱市某麝鼠養(yǎng)殖場(chǎng)訂購(gòu)6只體況相近的11月齡雄性麝鼠，每次采樣前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，分別在5月4日和9月1日隨機(jī)取3只麝鼠采用心臟注射法處死。取其腹腔下部的睪丸、前列腺和精囊腺，于液氮中速凍后放入凍存管中，準(zhǔn)備提取前列腺、精囊腺和睪丸的RNA。將采集的睪丸樣品記為ozt1、ozt2、ozt3、ozt4、ozt5和ozt6，將采集的前列腺樣品記為ozp1、ozp2、ozp3、ozp4、ozp5和ozp6，將采集的精囊樣品記為ozs1、ozs2、ozs3、ozs4、ozs5和ozs6，其中oz代表麝鼠，t代表睪丸，p代表前列腺，s代表精囊。

1.2 主要試劑、儀器與藥品

試驗(yàn)所用主要試劑見(jiàn)表1，主要儀器見(jiàn)表2。

表1 主要試劑及來(lái)源

表2 主要儀器

1.3 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將試驗(yàn)所需要的睪丸、精囊與前列腺組織放入研缽中，加入液氮快速研磨；研磨充分后加入適量的TRIZol試劑，離心，取上清液，加入氯仿，使上清液三相分離后取水相，加入足量的乙醇使RNA沉淀，于純化柱中洗脫RNA；最后加入RiboLock RNase Inhibitor保存RNA。使用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，檢驗(yàn)RNA的完整性。如可見(jiàn)兩條清晰的條帶，則使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GodlenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

使用相對(duì)定量RT-qPCR的方法檢測(cè)Cytc、Apaf-1和Caspase-9基因的mRNA表達(dá)水平，利用Primer Premier 6設(shè)計(jì)Cytc、Apaf-1和Caspase-9的熒光引物，試驗(yàn)中用到的內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白（β-actin）。內(nèi)參基因的引物序列參考了陸路［7］的研究，Cytc、Apaf-1、Caspase-9及β-actin的基因序列見(jiàn)表1。RT-qPCR體系：L SYBRGREEN 10μL，模板cDNA 2μL，10μmol/μL上下游引物各1.0μL，用水補(bǔ)至20μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：95℃10 min；95℃10 s、60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。退火時(shí)收集熒光信號(hào)。試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表3。

表3 試驗(yàn)所用引物序列

1.5 睪丸粗蛋白的提取與免疫印跡檢測(cè)

將睪丸組織放入研缽中，加入液氮，打碎，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞裂解液中，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，將提取的粗蛋白分裝，保存。將保存的粗蛋白煮沸，150 V電泳40 min，使蛋白分離，200 mA轉(zhuǎn)膜1 h，使蛋白附著到甲醇處理過(guò)的PVDF膜上，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h后顯色觀察。使用北京安諾達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)的Cytc抗體和β-actin抗體對(duì)蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

RT-qPCR擴(kuò)增后采用△△Ct法計(jì)算。

內(nèi)參基因均一化樣本差異：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

2個(gè)時(shí)期樣本表達(dá)差異：△△Ct=△Ct處理樣品-△Ct對(duì)照樣品；倍數(shù)變化=2-ΔΔCt。

兩組間結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05表示差異顯著，P≤0.01表示差異極顯著。

免疫印跡所得的圖像通過(guò)分析灰度值，計(jì)算不同時(shí)期的表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA濃度測(cè)定

試驗(yàn)提取的18個(gè)樣品的總RNA濃度見(jiàn)表4，樣品濃度由超微量分光光度計(jì)測(cè)量。

表4 總RNA濃度 mg·m L-1

2.2 Cytc基因的表達(dá)水平

Cytc基因在麝鼠非繁殖期的前列腺、精囊腺和睪丸中mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的3.44，3.75，6.54倍，見(jiàn)圖1，差異顯著（P≤0.05）。熔解曲線見(jiàn)圖2，表明反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增。

圖1 Cytc基因的表達(dá)水平

圖2 Cytc基因熔解曲線

2.3 Apaf-1基因表達(dá)水平

Apaf-1基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸中的mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的2.02，2.54，5.03倍，見(jiàn)圖3，差異顯著（P≤0.05）。熔解曲線結(jié)果見(jiàn)圖4，表明反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增。

圖3 Apaf-1基因的表達(dá)水平

圖4 Apaf-1基因熔解曲線

2.4 Caspase-9基因表達(dá)水平

Caspase-9基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸中的mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的4.13，8.11，10.04倍，見(jiàn)圖5，差異顯著（P≤0.05）。熔解曲線見(jiàn)圖6，表明反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增。

圖5 Caspase-9基因的表達(dá)水平

圖6 Caspase-9基因熔解曲線

2.5 Cytc免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果

Cytc在非繁殖期與繁殖期麝鼠睪丸的免疫印跡結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 Cytc免疫印跡結(jié)果

繁殖期與非繁殖期麝鼠睪丸Cytc蛋白的相對(duì)灰度值見(jiàn)圖8，可以看出Cytc蛋白在非繁殖期的表達(dá)水平高于繁殖期，二者間差異顯著（P≤0.05），與其mRNA在兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平變化一致。

圖8 Cytc灰度值

3 討論

麝鼠是季節(jié)性多次發(fā)情繁殖的多胎次動(dòng)物，一般6個(gè)月性成熟，性活躍期從3月持續(xù)到10月。由于中國(guó)東北地區(qū)氣候較嚴(yán)寒，故而該地區(qū)麝鼠的繁殖期為每年4—9月中下旬［4］。麝鼠的生殖腺會(huì)隨著繁殖發(fā)生規(guī)律性的變化，如睪丸會(huì)從3月起開(kāi)始逐漸發(fā)育，5月達(dá)到最大，8月生殖腺開(kāi)始逐漸萎縮，9月左右體積達(dá)到最小。通過(guò)解剖可以觀察到，麝鼠前列腺以及精囊腺也會(huì)隨著繁殖期的進(jìn)行逐漸發(fā)育，繁殖結(jié)束后逐漸萎縮。本試驗(yàn)選取了麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸周期變化過(guò)程中體積最大以及最小的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的比較分析。

Cytc即細(xì)胞色素C，是一種存在于線粒體膜間隙中的15 kD蛋白，可以從一種能與脫氧三磷酸腺苷激活Caspase-9酶原的凋亡細(xì)胞提取液中提純出來(lái)［5］。當(dāng)細(xì)胞受到各種外界刺激時(shí)線粒體會(huì)響應(yīng)凋亡信號(hào)，細(xì)胞色素C會(huì)從線粒體膜間隙被釋放到細(xì)胞漿中。在ATP存在的情況下，Cytc與Apaf-1結(jié)合。這種存在于胞質(zhì)中的復(fù)合體會(huì)募集并激活酶原Caspase-9，形成凋亡體，凋亡體會(huì)激活下游的Caspase-3，從而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。范小瑞等［6］研究表明，熱應(yīng)激處理導(dǎo)致豬睪丸中Cytc和Caspase-3蛋白和mRNA表達(dá)水平升高。

Apaf-1是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，包括Caspase募集結(jié)構(gòu)域、中央核苷酸結(jié)合域和具有調(diào)控功能的多個(gè)WD40重復(fù)序列［7］。該重復(fù)序列可以提供與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)。Cytc與WD40重復(fù)序列結(jié)合時(shí)，Apaf-1發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致核苷酸結(jié)合位點(diǎn)暴露于dATP/ATP，發(fā)生寡聚，Apaf-1組裝成輪狀的凋亡體復(fù)合體。A.R.Noori等［7］的研究證明Apaf-1蛋白低表達(dá)，是凋亡體形成和凋亡信號(hào)的限制因子。Apaf-1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控。Y.N.Li等［8］研究表明，Caspase-9酶原的激活和成熟Caspase-9的催化活性都嚴(yán)格依賴于凋亡體。

本研究結(jié)果顯示，Cytc基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸中的mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的3.44，3.75，6.54倍，睪丸中的轉(zhuǎn)錄水平變化最大。Apaf-1基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸中的mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的2.02，2.54，5.03倍，睪丸中的轉(zhuǎn)錄水平變化最高。Caspase-9基因在非繁殖期麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸中的mRNA表達(dá)水平約為繁殖期的4.13，8.11，10.04倍，睪丸中的轉(zhuǎn)錄水平變化最大。構(gòu)成凋亡體基因的mRNA表達(dá)水平變化極為顯著，并且變化規(guī)律一致，均為繁殖期表達(dá)水平低，非繁殖期表達(dá)水平高。對(duì)睪丸中Cytc的蛋白質(zhì)表達(dá)水平用免疫印跡方法進(jìn)行檢驗(yàn)，Cytc蛋白的表達(dá)水平依然是非繁殖期高，與其mRNA的表達(dá)水平變化一致。此結(jié)果提示，在麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸發(fā)育與萎縮的過(guò)程中，上述基因起著重要的調(diào)控作用。

在繁殖期，上述組織中Cytc等三個(gè)基因的表達(dá)水平低，凋亡體形成少，凋亡水平也相應(yīng)低，使組織快速發(fā)育、體積逐漸增大。在非繁殖期，上述三個(gè)基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)，凋亡體形成增多，細(xì)胞凋亡水平加快，導(dǎo)致睪丸體積比繁殖期減小。

上述三個(gè)基因在前列腺、精囊腺和睪丸三個(gè)組織的表達(dá)水平比較結(jié)果顯示，Cytc基因在繁殖期與非繁殖期麝鼠前列腺和精囊腺中的mRNA表達(dá)水平變化接近，而睪丸中的mRNA表達(dá)水平變化遠(yuǎn)高于二者。Apaf-1基因在繁殖期與非繁殖期麝鼠前列腺和精囊腺中的mRNA表達(dá)水平變化接近，睪丸的mRNA表達(dá)水平變化高于二者。推測(cè)前列腺與精囊腺相連，因此前列腺與精囊腺中的Cytc基因與Apaf-1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化相似。Caspase9基因在繁殖期與非繁殖期麝鼠睪丸和精囊腺中的mRNA表達(dá)水平變化接近，遠(yuǎn)高于前列腺中的mRNA表達(dá)水平。推測(cè)由于睪丸與精囊腺是儲(chǔ)存精子的場(chǎng)所，在繁殖期與非繁殖期體積變化顯著，Caspase9基因轉(zhuǎn)錄水平變化較大。

王承敏［9］的研究表明，Pten-PI3K/Akt通路參與調(diào)控了大鼠睪丸凋亡的過(guò)程，并且Akt基因間接調(diào)控了Cytc基因，影響著凋亡體的形成。黃海等［10］研究證明PI3K/Akt通路也參與了前列腺細(xì)胞的凋亡調(diào)控。從而提示了線粒體凋亡途徑中的相關(guān)基因，尤其是構(gòu)成凋亡體的3個(gè)基因，在麝鼠睪丸與前列腺的凋亡過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。

張宇等［11］研究表明，在繁殖期和非繁殖期麝鼠的前列腺組織中Bcl-2家族基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了顯著差異。Bcl-2家族基因參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，以Bcl-2基因?yàn)榇淼幕蚩梢砸种萍?xì)胞凋亡，而以Bax基因?yàn)榇淼囊活惢蚩梢源龠M(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族基因同時(shí)也是調(diào)控線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵基因，調(diào)控凋亡體的形成。這表明在前列腺凋亡的過(guò)程中，構(gòu)成凋亡體的基因起促進(jìn)組織凋亡的作用。

Cytc、Caspase-9和Apaf-1構(gòu)成的凋亡體在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起著重要的作用，凋亡體作為細(xì)胞執(zhí)行凋亡的重要標(biāo)志物，可以響應(yīng)細(xì)胞的凋亡信號(hào)，作為Caspase-9蛋白激活的平臺(tái)，促使Caspase-9蛋白多聚活化，Caspase-9蛋白活化后激活下游的效應(yīng)型Caspase蛋白，從而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)凋亡體3個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平的比較分析，提示其在麝鼠前列腺、精囊腺和睪丸周期變化過(guò)程中可能具有重要的調(diào)控作用，這為進(jìn)一步研究了解麝鼠繁殖腺發(fā)育、調(diào)控繁殖周期提供依據(jù)。