唾液miRNA-144miRNA-21聯(lián)合檢測對食管癌的診斷價值

古佳升， 吳偉東， 劉清峰， 桃卓嫣

食管癌是一種較常見的消化道惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布的報告[1]估計，全球每年食管癌新發(fā)患者約57.2萬例，病死人數(shù)約50.9萬例，其中有近一半新發(fā)病例和超過一半的死亡病例發(fā)生在亞洲地區(qū)，而中國的食管癌患者人數(shù)居全球首位。廣州市疾病預(yù)防控制中心2020年發(fā)布的《2004-2016年廣州市食管癌發(fā)病趨勢分析》[2]表明，相比于城區(qū)，郊縣和農(nóng)村地區(qū)的食管癌發(fā)病率上升趨勢明顯。治療食管癌的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。miRNAs作為一種參與了細(xì)胞間信號傳遞的非編碼RNA在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著極為重要的作用。miRNA-144是一種新發(fā)現(xiàn)的食管癌標(biāo)志物，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未形成完善的結(jié)論。本課題組的前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，食管癌患者唾液中miRNA-144呈高表達(dá)，且特異度高。檢測唾液中的miRNA具有成為診斷食管癌新方法的潛力[4]。miRNA-21與多種惡性腫瘤的血管侵襲能力有關(guān)，其在惡性腫瘤患者血漿中呈明顯高表達(dá)，且由于唾液腺有豐富的血供，故其在唾液中也可檢出[5-6]。鑒此，本研究旨在分析miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者唾液中的表達(dá)情況，探討這兩種miRNA基因標(biāo)志物的聯(lián)合檢測在食管癌早期診斷中的價值及意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年1月至2019年5月暨南大學(xué)附屬廣州市紅十字會醫(yī)院心胸外科收治的食管癌患者85例(病例組)，均經(jīng)病理活檢與免疫組化檢查確診，其中男37例，女48例，年齡均>60歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer,UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，0期14例，Ⅰ期22例，Ⅱ期11例，Ⅲ期11例，ⅣA期15例，ⅣB期12例。另同期招募本地社區(qū)來我院體檢的健康志愿者32名作為對照組，其中男18名，女14名，年齡均>60歲。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有高血壓、糖尿病及冠心病等慢性病史者；(2)有肝炎、結(jié)核及艾滋病等傳染性疾病者；(3)有染色體異常等遺傳病史者；(4)有其他惡性腫瘤者；(5)標(biāo)本采集期間有口腔潰瘍、口腔惡性腫瘤、牙周炎等口腔相關(guān)疾病者。

1.2樣本采集 在唾液標(biāo)本采集之前4 h內(nèi)，受試者須禁食、禁飲，無抽煙、喝酒行為。棉簽蘸取2%的檸檬酸后輕輕擦拭唾液腺開口處，每30 s擦拭1次，待唾液流出時使用無菌負(fù)壓吸痰器收集唾液，共5次，每次收集約2 ml唾液，共采集10 ml。在完成標(biāo)本收集工作2 h內(nèi)，將收集好的唾液置入4 ℃容器中，以3 000 r/min離心15 min以去除細(xì)胞沉淀以及食物殘渣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3唾液miRNA-144、miRNA-21檢測 參考既往研究[4]方法，取恒溫箱保存的唾液標(biāo)本置入1.5 ml EP管，采用Trizol法提取總RNA。應(yīng)用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI Fermentas，加拿大)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用Bio-Rad CFX96的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(50 μl體系)，miRNA-144、miRNA-21引物序列見表1，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PD)作為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以溴化乙錠染色，采用凝膠成像儀進(jìn)行掃膜成像。

表1 miRNA-144、miRNA-21引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組唾液中miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平比較 病例組唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組唾液中miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平比較 [M(P25，P75)，相對表達(dá)量]

2.2食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平與病理分期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平與病理分期存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。見表3。在0期～ⅣB期，miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平呈上升趨勢。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，miRNA-144和miRNA-21與臨床分期呈正相關(guān)(rs=0.556，P=0.000；rs=0.575，P=0.000)。

表3 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21在各分期中的表達(dá)水平比較相對表達(dá)量]

2.3唾液中miRNA-144和miRNA-21聯(lián)合檢測在食管癌患者中的診斷價值 以病理活檢結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，ROC曲線法分析結(jié)果顯示，唾液中miRNA-144和miRNA-21對食管癌均具有較好的診斷價值，且當(dāng)聯(lián)合兩指標(biāo)時，診斷效能進(jìn)一步提升。見圖1，2；表4。

圖1 食管癌患者唾液中miRNA-144的ROC曲線圖

圖2 食管癌患者唾液中miRNA-21的ROC曲線圖

表4 唾液中miRNA-144和miRNA-21對食管癌的診斷價值

3 討論

3.1食管癌是一種比較常見的消化道惡性腫瘤，由于中國人口基數(shù)大，全球有近一半的食管癌發(fā)生于我國，人數(shù)居全球首位[1]。食管癌早期癥狀不明顯，故其早期篩查和診斷主要采用有創(chuàng)傷性方法，包括食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞檢測技術(shù)、消化道內(nèi)鏡技術(shù)等[8-9]。這些篩查技術(shù)在檢查的過程中會給患者造成創(chuàng)傷，且檢查費(fèi)用較高，難以實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模的人群篩查，早期篩查率低。大部分食管癌患者確診時已屬中晚期，失去根治性手術(shù)機(jī)會[10]。而如果患者能在早期通過準(zhǔn)確、有效的檢測手段發(fā)現(xiàn)病灶，并接受手術(shù)切除或免疫治療等方式，生存率可高達(dá)90%[11]。因此，為了實(shí)施預(yù)防管理和提高食管癌的治療效果，探尋一種檢測精準(zhǔn)、便捷且成本低廉的食管癌無創(chuàng)篩查技術(shù)和產(chǎn)品，具有重要意義。

3.2唾液是一種唾液腺分泌的弱酸性液體，由于唾液腺血供豐富，唾液中含有廣泛的蛋白質(zhì)、電解質(zhì)和核酸，且這些物質(zhì)來源廣泛，可反映個體的生理狀態(tài)[12-15]。miRNAs參與了細(xì)胞的生長、分化、凋亡和免疫過程，并在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用[13，16-18]。2009年P(guān)ark等[19]研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者唾液及唾液上清液中至少有50種miRNA呈高表達(dá)，且其降解速度慢，穩(wěn)定性較好。這為以miRNAs為標(biāo)志物對消化道腫瘤進(jìn)行早期鑒別提供了思路。

3.3如今，唾液檢測作為一種無創(chuàng)性的檢測技術(shù)，愈來愈多的研究集中于相關(guān)標(biāo)志物的開發(fā)，其中包括對遠(yuǎn)端組織和器官惡性腫瘤的檢測[15，18，20]。Setti等[21]通過系統(tǒng)評價的方式驗(yàn)證了唾液中的miRNAs可作為癌癥診斷的可靠生物標(biāo)志物。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本研究方法參考了最新的唾液分離與定量檢測方法[22]。本課題組的既往研究[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA-144在食管癌患者的唾液及唾液上清液中呈高表達(dá)，為進(jìn)一步研究其在食管癌早期篩查中的應(yīng)用價值提供了理論依據(jù)。而近期也有研究[3]間接驗(yàn)證了miRNA-144是影響食管癌患者預(yù)后的一個獨(dú)立危險因素。另外，有多項研究[6，23]表明，miRNA-21在消化道惡性腫瘤患者的血液中呈高表達(dá)，同時也有研究[5，24]顯示其在唾液中可以檢出。本研究結(jié)果顯示，與健康者相比，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達(dá)水平顯著提高，且與患者的病理分期存在關(guān)聯(lián)性，隨著腫瘤浸潤進(jìn)展以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的增加，唾液中兩種miRNA的表達(dá)水平上升。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-21和miRNA-144診斷食管癌的ROC曲線下面積分別為0.785、0.777，提示兩種標(biāo)志物均具有較好的診斷價值，且當(dāng)聯(lián)合兩者檢測時，診斷效能進(jìn)一步提升。

3.4相比于內(nèi)鏡活檢等檢查，目前唾液檢測對于遠(yuǎn)處腫瘤的診斷價值仍然有限，但其易采集、非侵入的優(yōu)勢值得關(guān)注，且患者更易接受，更適宜大規(guī)模人群的篩查。本研究針對miRNA-144、miRNA-21的發(fā)現(xiàn)可作為未來開發(fā)食管癌快速檢測試劑盒及儀器的理論基礎(chǔ)。但是本研究也存在一些不足之處：(1)研究針對>60歲的健康人群及食管癌確診患者進(jìn)行檢測，沒有納入良性病變組，這使得研究結(jié)論難以在鑒別食管異常增生或潰瘍的良惡性方面推廣。(2)研究未能在手術(shù)后或化療治療后隨訪患者唾液中miRNA-144、miRNA-21表達(dá)水平的變化情況，未能評判miRNA-144、miRNA-21對于預(yù)測患者預(yù)后的價值。在后續(xù)的研究中，我們將對此進(jìn)行完善，以進(jìn)一步評價miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者早期篩查診斷及預(yù)后預(yù)測中的價值。

綜上所述，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表達(dá)水平呈高表達(dá)，其聯(lián)合檢測具有應(yīng)用于食管癌早期篩查診斷的潛力。