牛A型多殺巴氏桿菌的分離鑒定

杜英立，吳翠蘭，陸 震，藍金紅★，曾令越，龍愛淑，李 軍★，彭 昊

（1.馬山縣動物疫病預(yù)防控制中心 530600；2. 廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 530001；3. 馬山縣百龍灘鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)林業(yè)和水利站 530618；4. 三江侗族自治縣動物疫病預(yù)防控制中心 545500）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種人畜共患的革蘭氏陰性菌[1]，正常存在于動物的上呼吸道，宿主動物在先天免疫應(yīng)答受損時(如病毒感染、免疫抑制、應(yīng)激等)，多殺性巴氏桿菌能夠突破扁桃體等機體防御屏障，進入下呼吸道，引起呼吸道疾病和全身感染，臨床可見于豬、牛、羊、兔的肺炎，牛和水牛的急性敗血癥，豬的萎縮性鼻炎和家禽的禽霍亂[2，3]。多殺性巴氏桿菌是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要病原，病牛表現(xiàn)為咳嗽、喘，精神沉郁、食欲減退、消瘦、呼吸困難等癥狀。時至今日，該病的發(fā)生并未減退，為此，本研究擬對某例病死牛進行病原分離、PCR擴增鑒定和鑒型，并進行藥物敏感性、致病性試驗，為其防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基、胰蛋白大豆肉湯購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌DNA提取試劑盒、2×ES Taq MasterMix等均購自北京康為世紀生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌微量生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR儀、凝膠成像儀購自Biorad公司。

1.2 試驗動物

體重為18～22 g的10只健康小鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 引物設(shè)計

按吳翠蘭等方法[4]合成多殺性巴氏桿菌（Pm）、A（B/D/E/F）型多殺性巴氏桿菌（Pm-A、Pm-B、Pm-D、Pm-E、Pm-F）的引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 病原的分離鑒定

無菌采取牛肺臟在胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基上進行接種，37℃培養(yǎng)24h后挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，再挑取純化后的菌落進行生化鑒定和PCR擴增鑒定。

1.5 致病性試驗

取10只小白鼠隨機分為2組，每組各5只。試驗組小鼠的攻毒劑量為0.3 mL/只，對照組則注射等量的生理鹽水，同等條件下培養(yǎng)，每天觀察小鼠狀況。

1.6 藥物敏感性試驗

采用NCCLS[5]推薦的K-B紙片法，選用阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星等12種抗菌藥物進行體外藥敏試驗。當(dāng)抑菌圈直徑≥15 mm，判斷為高敏；15mm＞抑菌圈直徑＞10 mm，判斷為中敏；抑菌圈直徑＜10 mm，判斷為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 病原的分離鑒定

病料接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板培養(yǎng)基生長有圓形小菌落。將分離到的菌接種于生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24 ～48 h后，該菌能不分解肝糖和乳糖，能分解葡萄糖、吲哚試驗為陽性，該生化反應(yīng)結(jié)果與符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。以該菌DNA為模板分別進行多殺性巴氏桿菌和多殺性巴氏桿菌不同血清型基因的PCR擴增鑒定，結(jié)果顯示能擴出456 bp和1048 bp的特異性條帶（圖1），表明在該菌為A型多殺性巴氏桿菌。

圖1 PCR擴增

2.2 致病性試驗結(jié)果

試驗組小鼠接種24 h內(nèi)全部死亡，而對照組小鼠未見異常。采集死亡小鼠的肺臟等臟器進行分菌，可從死亡小鼠肺中成功分離到A型多殺巴氏桿菌，由此可知，該分離株具有很強的致病性。

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

本試驗共用12種藥物對分離到的菌株進行藥物敏感性試驗，其結(jié)果見表2。分離菌對阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星高敏；對氟苯尼考、丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素中敏；對鏈霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素耐藥。

表2 藥物敏感性試驗結(jié)果

3 討論

多殺性巴氏桿菌可在許多動物和人類中引起急性或慢性感染。近年來，隨著廣西養(yǎng)牛業(yè)的蓬勃發(fā)展，牛只調(diào)運頻繁，牛巴氏桿菌病的流行和發(fā)生逐漸增多。本研究從病死牛的肺臟中分離到1株具有致病性的A型多殺巴氏桿菌，對阿米卡星和卡那霉素高敏，對鏈霉素、紅霉素和環(huán)丙沙星耐藥。

根據(jù)莢膜抗原，可將多殺巴氏桿菌分為5個血清型，分別為A型、B型、D型、E型和F型，其中A型和B型的毒力最強，感染動物的死亡率較高[6]。B型是中國牛群以前最流行的莢膜血清型，但近幾年來，我國頻頻報道從病死牛中分離到A型多殺巴氏桿菌[6-9]。牛A型多殺巴氏桿菌病的流行可能是由于目前巴氏桿菌疫苗主要是針對B型，而對A型的保護率差，因此，A型多殺巴氏桿菌疫苗的研究成為熱點。朱玲[10]、賀奮義[11]、嵇少澤[12]等均已對A型多殺巴氏桿菌候選疫苗的篩選做了相關(guān)性的研究。本研究分離到1株A型多殺巴氏桿菌，為A型疫苗的研制提供實驗材料。

藥敏試驗結(jié)果顯示，A型多殺巴氏桿菌存在廣泛的耐藥性。以往青霉素和鏈霉素是治療多殺巴氏桿菌病的首選藥物，通過本次結(jié)果來看，該菌均對青鏈霉素耐藥。耐藥菌株的出現(xiàn)，究其原因是藥物的不合理使用、耐藥基因的傳代等[13]。鑒于多重耐藥株的出現(xiàn)，現(xiàn)在研究著把研究瞄點轉(zhuǎn)向微生態(tài)制劑的研究。微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)微生態(tài)失調(diào)，保持生態(tài)平衡，提高動物的健康水平，達到防病治療的效果。