高向陽,張芳

(1.鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，鄭州 450064；2.鄭州市食品安全快速檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450064)

阿斯巴甜(C14H18N2O5)，白色結(jié)晶狀粉末，甜度約是蔗糖的200倍，在水中的最大溶解度為1%(25 ℃)。常溫下，在pH為3～5的弱酸性溶液中十分穩(wěn)定，高溫或高pH條件下會(huì)水解而導(dǎo)致甜味喪失[1-3]。阿力甜(C14H25N3O4S)，白色、無臭的結(jié)晶性粉末，甜度為蔗糖的2000倍以上，易溶于水。室溫下，阿力甜在弱酸溶液中半衰期為1～1.6年，在pH 5～8水溶液半衰期為5年[4-5]。阿斯巴甜和阿力甜廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，對糖尿病人無影響，但若過量食用，可能會(huì)造成人體肝臟被破壞、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、致癌等[6-10]。

目前，食品中測定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法、反高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜法(IC)等[11-26]，而且常用內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法或歸一化法進(jìn)行定量分析。這些測定方法操作繁雜，需測定空白溶液、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行復(fù)雜計(jì)算，工作效率較低。

混標(biāo)加樣法是一種新型分析技術(shù)，克服了上述分析方法的不足，只需取兩份同一標(biāo)準(zhǔn)液，一份不加試液，一份加一定體積的試液，混勻后在同一條件下進(jìn)行測定。以相同保留時(shí)間下組分色譜峰信號(hào)是否有增加進(jìn)行定性分析，以色譜峰信號(hào)值代入公式進(jìn)行定量分析，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定空白溶液，具有成本低、測定速度快、工作效率高、準(zhǔn)確度高、適用范圍廣等突出優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可口可樂、菊花晶、酸奶、濃縮果汁、巧克力制品：市售，購于鄭州市二七區(qū)馬寨鎮(zhèn)好又多超市。

甲醇(色譜純)、乙醇(優(yōu)級純)、阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品(C14H25N3O4S，CAS號(hào)：80863-62-3，含量為99.2%)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品(C14H18N2O5，CAS號(hào)：22839-47-0，含量為95%)：BePune實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

A100250多管渦旋混合儀 月旭科技股份有限公司；MS150/MS205DU電子天平(十萬分之一) 長沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司；英國Dynamica V18R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Utimate 3000 (2017LH131)高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)混合液的制備

乙醇-水(2+1)：取40 mL乙醇，用20 mL的水均勻混合。

80%-甲醇-水：取80 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

50%-甲醇-水：取50 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

阿斯巴甜和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制(0.50 mg/mL)：稱取阿斯巴甜0.02632 g(精確至0.0001 g)、阿力甜0.02520 g(精確至0.0001 g)，用水將阿斯巴甜和阿力甜分別溶解至50 mL容量瓶內(nèi)并定容至刻度，置于4 ℃左右的冰箱中保存，有效期為3個(gè)月。

阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的配制：將阿斯巴甜和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級稀釋，等濃度等體積混合。

1.3.2 試液的制備和測定

分別制得20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃左右冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。

1.3.2.1 碳酸飲料、固體飲料

稱取約5.0000 g(精確到0.001 g)碳酸飲料試樣于50 mL燒杯中，在超聲波振蕩器上除去二氧化碳，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用水定容，備用。

稱取約1.0000 g(精確到0.001 g)固體飲料試樣于50 mL燒杯中，加10 mL水，超聲波振蕩提取20 min，移入25 mL容量瓶中；再向燒杯中加入10 mL水超聲波振蕩提取10 min，將兩次提取液移入同一個(gè)25 mL容量瓶中，用水定容，混勻，備用。

將上述容量瓶的液體分別在4000 r/min離心機(jī)上離心5 min，用0.45 μm的水系濾膜過濾上清液后作為待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.2.2 酸奶、乳飲料

稱取5.0000 g(精確到0.001 g)酸奶于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇沉淀酸奶中的蛋白質(zhì)，蓋緊蓋子；上下輕輕顛倒離心管5次(不能振搖)，將離心管混勻渦旋10 s后，靜置1 min，用4000 r/min離心機(jī)離心5 min，取上清液濾入25 mL容量瓶中，濾渣用8 mL 乙醇-水(2+1)洗滌后再離心，上清液移入同一個(gè)容量瓶中，用乙醇-水(2+1)定容至25 mL，混勻，用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾后得待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

高效液相色譜儀：Utimate 3000(2017LH131)；色譜柱：Hypersil GOLD C18(150 mm×4.6 mm，SN：10567553)。流動(dòng)相：甲醇∶水為40∶60；流速：0.8 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：200.0 nm。

1.3.4 色譜分析方法

取兩份完全相同的混合標(biāo)準(zhǔn)液于離心管A和B中，離心管B中加入待測試液混勻。在同一色譜條件下，對離心管A中混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行色譜分析，得出阿斯巴甜的保留時(shí)間ts1及對應(yīng)的出峰信號(hào)hs1、阿力甜的保留時(shí)間ts2及對應(yīng)的出峰信號(hào)hs2；對離心管B中混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行色譜分析，得出阿斯巴甜的保留時(shí)間t1及對應(yīng)的出峰信號(hào)hs1+x1、阿力甜的保留時(shí)間t2及對應(yīng)的出峰信號(hào)hs2+x2。當(dāng)ts1=t1，hs1+x1-hs1>0時(shí)，則待測食品中含有阿斯巴甜；當(dāng)ts2=t2，hs2+x2-hs2>0時(shí)，則待測食品中含有阿力甜。

1.3.5 測定原理和公式

在一定條件下測定時(shí)，混合液的質(zhì)量與產(chǎn)生的測定信號(hào)在一定的范圍內(nèi)成正比，則有：

ms=ks×hs。

(1)

ms+mx=ks+x×hs+x。

(2)

在完全相同的條件下測定時(shí)，公式(1)、(2)中的k相同，因此，公式(1)除以公式(2)有：

因此，

(3)

(4)

式中：ms為阿斯巴甜或阿力甜在混合標(biāo)準(zhǔn)液中的質(zhì)量，hs為對應(yīng)于ms所產(chǎn)生的測定信號(hào)，mx為混合標(biāo)準(zhǔn)液加入待測試液，試液中阿斯巴甜或阿力甜的質(zhì)量，hs+x為對應(yīng)于(ms+mx)所產(chǎn)生的測定信號(hào)，m樣為待測試液中所含稱取樣品的質(zhì)量，w為阿斯巴甜或阿力甜在待測樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加樣法色譜圖比較分析

取兩個(gè)相同的離心管A和B，各加入1 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液45 μL，A管中不加待測試液，B管中加入100 μL可口可樂待測試液，均定容至1.00 mL，混勻后進(jìn)行色譜分析。A管得到的液相色譜圖見圖1，B管的液相色譜圖見圖2。

圖1 阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution

圖2 阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液加入可口可樂的色譜圖Fig.2 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution added with Coca-Cola

由圖1和圖2可知，阿斯巴甜和阿力甜在各自保留時(shí)間下，加入可口可樂后，各自的峰高均有增加。保留時(shí)間允許的誤差范圍內(nèi)ts1=t1，hs1+x1-hs1>0，則可口可樂中含有阿斯巴甜；ts2=t2，hs2+x2-hs2>0，則可口可樂中含有阿力甜，同理，可對其他樣品進(jìn)行定性分析。

根據(jù)圖1可得，阿斯巴甜的保留時(shí)間ts1為3.640 min，峰高h(yuǎn)s1為3.852 mAU；阿力甜的保留時(shí)間ts2為6.497 min，峰高h(yuǎn)s2為2.654 mAU；根據(jù)圖2可得，阿斯巴甜的保留時(shí)間t1為3.640 min，峰高h(yuǎn)s1+x1為9.925 mAU；阿力甜的保留時(shí)間t2為6.527 min，峰高h(yuǎn)s2+x2為6.242 mAU。根據(jù)色譜圖的峰高，依據(jù)公式(3)、(4)可對樣品中的組分進(jìn)行定量分析。

2.2 加樣法測定結(jié)果及精密度

表1 樣品的測定結(jié)果Table 1 The determination results of samples

續(xù) 表

由表1可知，5種試樣測定的RSD均小于5%。由色譜峰高值可簡便、快速計(jì)算出食品中待測組分的含量，也可用峰面積數(shù)據(jù)代入相應(yīng)公式計(jì)算。

2.3 樣品的檢出限和定量限

根據(jù)表1，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限，按10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算定量限。5種待測食品中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限、定量限見表2。

表2 樣品的檢出限和定量限Table 2 The detection limits and quantitative limits of samples mg/kg

由GB 5009.263-2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》的檢出限和定量限可知[27]，碳酸飲料、液態(tài)乳飲料中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為1.0 mg/kg，定量限為3.0 mg/kg；濃縮果汁中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為2.5 mg/kg，定量限為7.5 mg/kg；巧克力制品、水果及其制品、固體飲料及其制品中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為5.0 mg/kg，定量限為15.0 mg/kg。該方法的檢出限和定量限均低于國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中的檢出限和定量限。

2.4 加標(biāo)回收率

以酸奶測定加標(biāo)回收率，分別對樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收，每個(gè)水平做6次平行測定，檢驗(yàn)無可疑值后，取峰高平均值計(jì)算，見表3。

表3 樣品的加標(biāo)回收率Table 3 The standard recovery rates of samples

由表3可知，酸奶中阿斯巴甜的回收率為90.3%～97.2%，阿力甜的回收率為91.0%～96.8%。由于各組分在色譜柱中得到了充分分離，互不干擾，該法尤其適用于多組分的色譜定性和定量分析，由各組分依次出現(xiàn)的色譜峰信號(hào)值，可快速計(jì)算各組分含量和回收率。

2.5 國標(biāo)法對比實(shí)驗(yàn)

2.5.1 國標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

按國標(biāo)法規(guī)定的波長和色譜條件，以50.00，45.00，40.00，35.00，30.00，25.00，20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液各進(jìn)樣5 μL測定，以組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出阿斯巴甜的回歸直線方程為Y=4.6921X-1.4649，阿力甜的回歸直線方程為Y=2.8836X-1.1944，相關(guān)系數(shù)r均為0.9999。

2.5.2 國標(biāo)法測定結(jié)果

按國標(biāo)法操作步驟，各樣品均進(jìn)行6次平行測定，檢驗(yàn)無可疑值后取平均值，見表4。

表4 國標(biāo)法測定結(jié)果Table 4 The determination results of national standard method

由表4可知，國標(biāo)法采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中待測物質(zhì)的含量。結(jié)果表明：酸奶中阿斯巴甜和阿力甜含量最低，含量最高的為巧克力；阿斯巴甜的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%～4.8%，阿力甜的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%～3.8%。

2.6 顯著性檢驗(yàn)

以酸奶為樣品，樣品前處理依據(jù)GB 5009.263-2016，用該法和國標(biāo)法進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，各樣品進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果見表5。

表5 對照測定結(jié)果Table 5 The comparison of determination results

由表5中數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[28]可知，計(jì)算出的F值小于F檢驗(yàn)表中F0.05=5.05，表明混標(biāo)加樣法與國標(biāo)法之間不存在顯著的偶然誤差。計(jì)算出的t值小于t檢驗(yàn)表中t0.05=2.23，表明混標(biāo)加樣法與國標(biāo)法間也不存在顯著的系統(tǒng)誤差，結(jié)論的置信度為95%。

3 結(jié)論

方法所用標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測液和試劑量少，成本低，操作簡單，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，無需測定空白和復(fù)雜計(jì)算，可快速獲得分析結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)溶液和試液在同溶液背景、同體系、同方法、同儀器、同條件、同步操作下進(jìn)行同時(shí)定性、定量分析，準(zhǔn)確度得到保障和提升，有一定的創(chuàng)新性。由于各組分在色譜柱中得到了充分的分離，相互之間不干擾，尤其適用于色譜多組分的同時(shí)定性和定量分析。與國標(biāo)法對照，用于測定食品中的阿斯巴甜和阿力甜，經(jīng)檢驗(yàn)無顯著性差異。

該法不僅適用于液相色譜法，也適用于氣相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、毛細(xì)管電泳色譜法，以及化學(xué)發(fā)光、分子熒光、磷光分析法、生物發(fā)光分析法、原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、原子熒光光譜和紫外可見分子吸收光譜等諸多分析技術(shù)，不僅適用于阿斯巴甜和阿力甜的測定，也適用于其他物質(zhì)諸多組分的測定。根據(jù)所用方法不同，測定信號(hào)可以是色譜峰峰面積、色譜峰峰高、吸光度A、相對發(fā)光強(qiáng)度I等，方法的可行性和推廣應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。