裴文剛，常秉乾，楊敏敏，王海波，秦士貞 ，史兆國 ，李志勇

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅德福生物科技有限公司，甘肅 定西 744300）

0 引言

【研究意義】維持正常的免疫功能是肉雞抵抗疾病和健康快速生長的基礎(chǔ)，但在集約化養(yǎng)殖模式下，抗生素和其他抗病藥物的大量使用導(dǎo)致肉雞免疫水平普遍低下，抗病力下降，傳染性疾病發(fā)病率上升，免疫抑制性疾病危害日益增大，給肉雞養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)[1]。小球藻是一種單細(xì)胞綠藻，在我國分布廣泛，尤其以淡水水域較多，其不僅能利用光能自養(yǎng)，還能在異養(yǎng)條件下利用有機(jī)碳源進(jìn)行生長繁殖，且易于人工培養(yǎng)[2]。小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、必需氨基酸、脂肪酸、類胡蘿卜素和礦物元素，具有全面而均衡的營養(yǎng)價(jià)值和生物保健功能[3]。小球藻生長因子（CGF）是小球藻獨(dú)有的活性成分，具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病力等功能[4－5]。金藻液由有效微生物群（EM）和小球藻懸浮液混合發(fā)酵而成，通過微生物發(fā)酵可以使小球藻達(dá)到較好的破壁和脫腥效果，從而提高動(dòng)物的吸收率和攝入量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】諸多研究發(fā)現(xiàn)，小球藻及其活性成分CGF具有促進(jìn)動(dòng)物生長、增強(qiáng)免疫功能、解毒保肝、抗腫瘤和維持動(dòng)物胃腸道內(nèi)菌群的均衡等重要作用[6]。飼糧中添加小球藻能改善飼糧中蛋白質(zhì)和維生素的代謝過程，提高肉雞生產(chǎn)性能，增強(qiáng)免疫力，提高成活率[7]。益生菌發(fā)酵小球藻在提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)、肝臟三酰甘油含量和盲腸菌群分布方面的作用效果顯著高于普通小球藻[8]。近年來，諸多研究人員通過對肉雞進(jìn)行營養(yǎng)調(diào)控或在肉雞飼糧中添加酶制劑、中草藥和微生態(tài)制等添加劑的方式代替抗生素以提高肉雞的免疫力和抗病力并取得了不錯(cuò)的效果[9]。本課題組以良鳳肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，其每天定量飼喂小球藻懸浮液、金藻液和二者聯(lián)用液。結(jié)果表明，三者均能不同程度改善肉雞的生長性能和屠宰性能[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著我國藻類生物技術(shù)的發(fā)展，將小球藻干粉作為飼料添加劑在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫功能方面的研究已有初步探索，但小球藻懸浮液和金藻液在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從小球藻的免疫活性這一研究熱點(diǎn)出發(fā)，旨在探究小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫功能的影響，以期為其在肉雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小球藻懸浮液和金藻液由甘肅德福生物科技有限公司提供。小球藻懸浮液，pH值7.5～8.0，主要有效成分為小球藻活細(xì)胞，藻細(xì)胞含量＞2.0×107個(gè)·mL－1。金藻液由小球藻懸浮液和EM混合發(fā)酵而成，pH值3.0～3.5，主要有效成分為CGF（氨基酸；多肽；核苷酸；多糖；維生素等）和EM益生菌（光合細(xì)菌；乳酸桿菌；酵母菌；芽孢桿菌；放線菌群），有效活菌數(shù)＞1010個(gè)·mL－1。發(fā)酵過程對小球藻的養(yǎng)分組成也具有改善作用，主要營養(yǎng)成分變化如表1所示。

表1 小球藻和金藻液主要營養(yǎng)成分對比（DM基礎(chǔ)）Table 1 Major differences on nutrients in NCS and FCS (on DM basis) （單位：mg·g－1）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康且體重相近的1日齡良鳳肉雞（公雛）480只，隨機(jī)分為4組，每組各120只（每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只）。以正大肉雞料為基礎(chǔ)飼糧，對照組正常飲水，試驗(yàn)組肉雞每日分別在飲水中添加30 mL小球藻懸浮液、1 mL金藻液、30 mL小球藻懸浮液+1 mL金藻液。試驗(yàn)期為70 d。試驗(yàn)動(dòng)物處理與分組如表2所示。

表2 試驗(yàn)動(dòng)物處理與分組Table 2 Treatments and groups of broilers for experimentation

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)肉雞采用籠養(yǎng)方式，試驗(yàn)期間自由采食和飲水，白天自然光照，夜間輔以人工補(bǔ)光，常規(guī)免疫。雞舍通風(fēng)良好，舍內(nèi)溫度與濕度保持穩(wěn)定且適宜。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 血液免疫指標(biāo) 70日齡，每組選取5只體重接近該組平均水平的肉雞活體翅下靜脈采血，血液3 500 r·min－1離心15 min，取上層血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別對血清中IgA、IgG、IgM及免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和 IFN-γ的濃度進(jìn)行測定（北京英華生物），詳細(xì)實(shí)驗(yàn) 步驟參考試劑盒說明書。

1.4.2 免疫器官指數(shù) 試驗(yàn)肉雞進(jìn)行空腹屠宰。摘取脾臟和胸腺，用吸水紙擦干后稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺重（g）/活重（kg） 脾臟指數(shù)=脾臟重（g）/活重（kg）

1.4.3 組織切片制備及觀察 稱重后的脾臟和胸腺放入4%多聚甲醛固定液中固定。固定超過24 h后，對組織進(jìn)行修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋，切片。脾臟與胸腺切片厚度均為6 μm，每隔20刀取一張切片，每個(gè)樣品做10張重復(fù)。隨后HE染色；蘇木精染色40 s，伊紅染色1 min；最后用中性樹脂封片。選取5個(gè)視野進(jìn)行圖片采集。制作好的切片用Olympus系統(tǒng)顯微鏡分別在不同放大倍數(shù)下觀察脾臟和 胸腺組織結(jié)構(gòu)，每張切片均勻。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 21.0軟件單因素方差分析差（One-way ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，差異顯著者，以LSD法比較平均數(shù)間的差異顯著性。以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)志，試驗(yàn)結(jié)果用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫器官發(fā)育的影 響

2.1.1 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫器官指數(shù)的影響 如表3所示，添加小球藻懸浮液、金藻液及聯(lián)用液對試驗(yàn)肉雞的胸腺指數(shù)產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05），對脾臟指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，試驗(yàn)組胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），金藻液組與聯(lián)用組顯著高于小球藻組（P＞0.05），但金藻液組與聯(lián)用組差異不顯著（P＞0.05）。小球藻組、金藻液組和聯(lián)用組脾臟指數(shù)與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

表3 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of NCS and FCS on broiler immune organ indices

2.1.2 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫器官組織結(jié)構(gòu)的影響 如圖1所示，對照組視野內(nèi)脾小結(jié)數(shù)量較少，紅髓占據(jù)面積居多（圖1-A）；脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘松散不發(fā)達(dá)，輪廓不清晰，脾小結(jié)形狀不規(guī)則（圖1-E）。與對照組相比，小球藻組脾小結(jié)數(shù)目較多，形狀呈規(guī)則的圓形或橢圓形，白髓和紅髓交界區(qū)域較明顯（圖1-B）；脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘發(fā)達(dá)且輪廓較清晰（圖1-F）。金藻液組脾小結(jié)形狀規(guī)則，白髓和紅髓界限明顯，脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘發(fā)達(dá)（圖1-G）。聯(lián)用組脾小結(jié)數(shù)量較多，形狀規(guī)則，脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘很發(fā)達(dá)（圖1-H）。對照組胸腺小葉的皮質(zhì)部較薄，面積偏小，髓質(zhì)占總面積比例較大（圖1-I）；皮質(zhì)和髓質(zhì)分界不明顯，皮質(zhì)部小葉間隔不清晰，間隔內(nèi)僅見小的毛細(xì)血管分布，髓質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管不發(fā)達(dá)（圖1-M）。與對照組相比，小球藻組皮質(zhì)厚度有所增加，與髓質(zhì)界限較為清晰（圖1-J）；小葉間隔較明顯，髓質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管較發(fā)達(dá)（圖1-N）。金藻液組胸腺皮質(zhì)厚度較對照組有所增加（圖1-K）；皮質(zhì)邊緣淋巴細(xì)胞排列密集，髓質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管發(fā)達(dá)，可見典型胸腺小體（圖1-O）。聯(lián)用組胸腺小葉明顯增大，間隔明顯，皮質(zhì)厚度較對照組和其他試驗(yàn)組均增加（圖1-L）；皮質(zhì)邊緣淋巴系統(tǒng)發(fā)達(dá)，髓質(zhì)內(nèi)小體數(shù)目增多，毛細(xì)血管網(wǎng)非常發(fā)達(dá)（ 圖1-P）。

圖1 小球藻懸浮液與金藻液對肉雞免疫器官組織結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of NCS and FCS on tissue structures of broiler immune organs

2.2 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血液免疫指標(biāo)的影 響

2.2.1 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清中免疫球蛋白含量的影響 由表4可知，添金藻液和聯(lián)用液對肉雞血清中IgG含量產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05），對IgA和IgM含量無顯著性影響（P＞0.05）。與對照相比，金藻液組與聯(lián)用組IgG含量顯著升高（P＜0.05），小球藻組無顯著差異（P＞0.05）。小球藻組、金藻液組和聯(lián)用組IgA含量與對照組無顯著差異（P＞0.05）。金藻液組、聯(lián)用組和對照組兩兩相比 差異不顯著（P＞0.05）。

表4 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清免疫球蛋白含量的影響Table 4 Effects of NCS and FCS on serum immunoglobulin in broilers

2.2.2 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清中細(xì)胞因子含量的影響 由表5可知，添加小球藻懸浮液、金藻液和聯(lián)用液對肉雞血清中TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-4、IL-6的含量產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05）。與對照組相比，聯(lián)用組血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6含量顯著降低（P＜0.05），IL-4含量顯著升高（P＜0.05）。金藻液組血清中IL-1β、IL-6含量相比對照組顯著降低（P＜0.05），IL-4含量顯著升高（P＜0.05），TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-6含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。小球藻組除了IL-2以外，其他細(xì)胞因子含量較對照組均降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

表5 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清細(xì)胞因子含量的影響Table 5 Effects of NCS and FCS on serum cytokine in broilers

3 討論

3.1 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞免疫器官發(fā)育的影響

免疫器官指數(shù)是反應(yīng)動(dòng)物免疫功能的一個(gè)重要標(biāo)志，通常認(rèn)為，免疫器官指數(shù)增加是免疫器官發(fā)育良好，機(jī)體免疫功能增強(qiáng)的表現(xiàn)，而免疫器官指數(shù)下降是免疫器官發(fā)育不良，機(jī)體免疫受到抑制的表現(xiàn)[11]。免疫器官的組織結(jié)構(gòu)也是反應(yīng)免疫器官發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)，脾臟和胸腺組織的完全發(fā)育為淋巴細(xì)胞及行使其免疫功能提供了充分的組織基礎(chǔ)，其發(fā)育的強(qiáng)弱，直接決定著禽類全身的免疫水平[12]。小球藻（干物質(zhì)基礎(chǔ)）蛋白質(zhì)含量高達(dá)55%～65%，但具有細(xì)胞壁，因此動(dòng)物對其蛋白的利用效率并不高[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，小球藻通過微生物發(fā)酵不僅可以達(dá)到破壁效果，且通過益生菌代謝過程可將小球藻蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為多肽和氨基酸，使發(fā)酵液中多肽、總氨基酸和必需氨基酸含量顯著升高，從而使氨基酸利用率大幅度提高[14]。小球藻生長因子（CGF）中含有多種游離氨基酸、多肽、小球藻水溶性多糖（CWSP）、糖蛋白、維生素等成分，其中CWSP可促進(jìn)機(jī)體器官細(xì)胞的生長和分裂，進(jìn)而促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力[15－16]。EM由光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌等多種益生菌組成，具有改善動(dòng)物腸道菌群、促進(jìn)動(dòng)物的生長和提高免疫力等功能[17]。研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠每天口腔灌服150 mg·（kg·BW）－1和75 mg·（kg·BW）－1的CGF，可增加小鼠胸腺和脾臟的重量[18]。本研究結(jié)果表明，小球藻懸浮液、金藻液和聯(lián)用液均顯著提高了肉雞的胸腺指數(shù)，且改善了胸腺和脾臟的組織結(jié)構(gòu)，與上述研究結(jié)果基本一致。其主要原因可能與小球藻和金藻液所含的CGF發(fā)揮的作用有關(guān)。本試驗(yàn)中金藻液組和聯(lián)用組肉雞的胸腺指數(shù)高于小球藻組，其主要原因可能有兩個(gè)方面，一方面是因?yàn)榻鹪逡褐泻写罅康囊嫔怆u飼糧中添加益生菌可以有效增強(qiáng)肉雞的免疫功能，對免疫器官的發(fā)育也有顯著的促進(jìn)作用[19]。另一方面是因?yàn)榻鹪逡褐懈鞣N氨基酸含量遠(yuǎn)高于小球藻懸浮液，研究發(fā)現(xiàn)通過營養(yǎng)調(diào)控增加肉雞飼糧中蛋氨酸、精氨酸和蘇氨酸等的含量均可以促進(jìn)免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)肉雞的免疫調(diào)節(jié)能力[20]。但具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清中免疫球蛋白含量的影響

免疫球蛋白是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，其在血液中的含量是反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志。IgG是體液免疫應(yīng)答最主要的抗體，在血液中含量最高，占免疫球蛋白總量的75%；IgA 的主要作用是參與黏膜局部免疫；IgM主要在脾臟中產(chǎn)生，是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的最大抗體，也是接觸抗原后首先發(fā)生反應(yīng)的第一抗體[21]。Kang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加1%新鮮小球藻液可以顯著提高血液中白細(xì)胞的數(shù)量和血清中的IgA、IgG和IgM的含量。復(fù)合益生菌制劑可以顯著提高肉雞血清中的免疫球蛋白含量，從而增強(qiáng)肉雞的免疫力[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)試驗(yàn)組IgG、IgA和IgM含量都有所提高，這可能是小球藻水溶性多糖（CWSP）刺激了淋巴細(xì)胞使其對免疫球蛋白的分泌量增加所致[24]。而金藻液組和聯(lián)用組IgG含量高于小球藻組，可能與其中益生菌的協(xié)同作用有關(guān)。

3.3 小球藻懸浮液和金藻液對肉雞血清中細(xì)胞因子含量的影響

機(jī)體特異性免疫可分為細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫由T細(xì)胞分泌的一系列細(xì)胞因子介導(dǎo)完成。T細(xì)胞根據(jù)其分泌功能不同可分為Th1型和Th2型兩類，Th1細(xì)胞分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，主要在炎癥過程、巨噬細(xì)胞激活和敏感性延遲等細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮作用。Th2細(xì)胞分泌IL-4和IL-10等細(xì)胞因子，主要參與抗炎性過程，并輔助B細(xì)胞合成抗體。因此，血液中Th1型和Th2型細(xì)胞因子的水平可以直接反映動(dòng)物機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫狀態(tài)[25]。諸多研究表明，血液中IL-1、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子含量升高，會(huì)誘導(dǎo)氧自由基生成，造成體內(nèi)重要臟器與組織的氧化損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而降低畜禽的生產(chǎn)性能，而IL-4和IL-10等可抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，緩解組織氧化損傷和炎癥反應(yīng)[26－27]。有動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小球藻熱水抽提物（CVE）通過激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)Th1，從而調(diào)控細(xì)胞免疫過程中IL-2、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，使小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力得到提高[17]。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組肉雞血清中促炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL1-β、IL-2、IL-6含量均降低，抗炎性因子IL-4含量升高。說明添加小球藻懸浮液和金藻液后肉雞的免疫調(diào)節(jié)能力有所增強(qiáng)，與上述研究結(jié)果基本相符。諸多研究表明，EM中的益生菌可以作為非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)[28]。因此，金藻液和聯(lián)用液對肉雞細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)機(jī)制可能也與其中益生菌調(diào)節(jié)的作用有關(guān)。

4 結(jié)論

添加小球藻懸浮液和金藻液均能促進(jìn)肉雞免疫器官的發(fā)育，提高免疫器官指數(shù)，改善免疫器官組織結(jié)構(gòu)。提高肉雞血清中免疫球蛋白的含量，抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的合成，對肉雞免疫功能具有一定的增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用。