劉學(xué)艷,王 娟,彭 云,呂才有,李若愚
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院,云南昆明 650201)
云南省西雙版納勐海縣是聞名中外的普洱茶故鄉(xiāng),有豐富的古茶樹群。勐??h具有“中國普洱茶第一縣”的美譽(yù),其南糯山、賀開、納卡、布朗山是全國著名的茶葉產(chǎn)地,擁有“老班章”等著名普洱茶品牌。勐海普洱茶“湯色黃綠明亮、香氣純正持久、滋味醇厚回甘”,具有獨(dú)特“勐海味”[1],其豐富的文化底蘊(yùn)及國內(nèi)外公認(rèn)的保健功效賦予了普洱茶無窮的發(fā)展?jié)摿途C合價(jià)值[2?3]。勐海曬青毛茶作為純正勐海普洱茶的唯一原料,其主要內(nèi)含成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì),加工工藝的研究尤其重要。勐海曬青毛茶一般選用國家級茶樹良種—勐海大葉種茶樹鮮葉經(jīng)攤晾、殺青、揉捻后,采用太陽光曬干而成[4]。勐海曬青毛茶水浸出物含量高達(dá)40%以上[5],氨基酸、可溶性糖和咖啡堿等含量與普洱、保山等地的曬青毛茶有極顯著差異[6],豐富的兒茶素等內(nèi)含物質(zhì)為勐海曬青毛茶的抗氧化等功效奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[7,8]。作為普洱茶的原材料,曬青毛茶的品質(zhì)是優(yōu)質(zhì)普洱茶的基礎(chǔ)[9]。近年來,越來越多的人追求未經(jīng)后發(fā)酵的曬青茶,認(rèn)為曬青茶更能體現(xiàn)勐海茶“一山一味”的特征。為了探明“一山一味”的形成原因,很多學(xué)者做過相關(guān)研究。例如蔡麗等[10]使用HPLC 法測定了勐??h10 個(gè)曬青毛茶樣品的兒茶素,發(fā)現(xiàn)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)曬青毛茶樣品中兒茶素單體含量差異顯著,田小軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)曬青毛茶主要香氣為醇類、酮類和碳?xì)浠衔?,與未經(jīng)儲藏的普洱生茶品質(zhì)相似。劉敏等[12]研究認(rèn)為曬青毛茶的主要香氣成分由芳樟醇,其次為α-松油醇、香葉醇、4-苯基吡啶和葉綠醇等構(gòu)成。Wu等[13]選取了景邁和無量山的云南大葉種曬青毛茶分析其香氣特點(diǎn),還有人研究了人工光源對曬青綠茶品質(zhì)的影響[14]。
近年來,常用于茶葉揮發(fā)性組分分離鑒別方法主要有拉曼光譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等[15]。氣相離子遷移譜GC-IMS 是最近幾年常用于用于食品風(fēng)味檢測的技術(shù)[16],例如橄欖油的分類[17],細(xì)菌的檢測鑒定[18],金華火腿[19]腌豬肉[20]等食用肉類的香氣鑒別分析。此技術(shù)將氣相色譜GC與離子遷移譜IMS 相結(jié)合[21],兩者聯(lián)用既可提高GC 技術(shù)的檢測靈敏度,還能顯著提高IMS 技術(shù)的分辨率和線性響應(yīng)范圍[22]。GC-IMS 技術(shù)沒有復(fù)雜的樣品前處理過程,可以保證茶葉中香氣物質(zhì)不因前處理發(fā)生改變或流失,更準(zhǔn)確地對茶葉香氣物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[23]。林若川[24]、江津津[25]、金文剛[26]分別將此技術(shù)應(yīng)用于綠茶、柑普茶、“漢中仙毫”的氣味指紋差異分析,均認(rèn)為此技術(shù)可用于茶葉揮發(fā)性組分的快速鑒別,也可用于茶葉產(chǎn)地區(qū)分,質(zhì)量評估等。
前人大量的研究集中于普洱茶的研究[27?28],或者是勐海曬青毛茶的常規(guī)成分測定以及安全性研究[29],對于勐??h曬青毛茶的揮發(fā)性組分研究極少。因此,本文選取了勐??h3 個(gè)主產(chǎn)地的12 份曬青毛茶樣品,使用GC-IMS 技術(shù),較準(zhǔn)確地分離和定性樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物組分,旨在深入研究勐海曬青毛茶的揮發(fā)性組分以及三個(gè)主產(chǎn)地樣品之間的異同點(diǎn)。
曬青毛茶 共12 份,分別來自勐??h的布朗山鄉(xiāng)、勐宋鄉(xiāng)、格朗和鄉(xiāng),每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)4 份樣品,均為2019年春茶,詳細(xì)信息見表1,由云南省西雙版納州勐??h農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站提供。
表1 勐海縣12 份曬青毛茶樣品信息Table 1 12 Sun-dried green tea samples’ informations of Menghai county
FlavourSpec 食品風(fēng)味分析儀(含CTC 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件、GC×IMS Library Search 軟件及軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫) 德國G.A.S 公司。
1.2.1 樣品處理 使用感量為0.01 g 的精密電子天平,分別稱取1 g 曬青毛茶樣品于20 mL 頂空瓶中,80 ℃條件下頂空孵育15 min 后進(jìn)樣。每份樣品做3 組平行實(shí)驗(yàn),頂空進(jìn)樣后用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀直接測試,測定結(jié)束后,使用用儀器自帶的VOCal 和三款插件(Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA)進(jìn)行離子遷移譜、差異圖譜和主成分分析。頂空進(jìn)樣體積為500 μL;進(jìn)樣針溫度為85 ℃;孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。
1.2.2 GC-IMS 條件 色譜柱類型:MXT-5(15 m×0.53 mm×1 μm);柱溫:60 ℃;載氣:高純N2,純度≥99.999%;運(yùn)行時(shí)間:20 min;氣體流量:載氣起始流速2 mL/min,保持2 min 后,18 min 內(nèi)線性增至100 mL/min,漂移氣持續(xù)20 min 保持150 mL/min的流速。
數(shù)據(jù)分析采用儀器配套的分析軟件 LAV (Laboratory Analytical Viewer)和三款插件以及GCIMS Library Search.我們先用LAV 軟件繪制并分析譜圖,圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物;利用Reporter 插件直觀對比樣品之間譜圖差異;利用Dynamic PCA 插件進(jìn)行動(dòng)態(tài)主成分分析,可以將樣品進(jìn)行聚類;利用GC×IMS Library Search 應(yīng)用軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對茶樣揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行二維定性分析;利用Gallery Plot 插件建立茶樣HS-GC-IMS 譜圖中VOCs 的指紋圖譜,對不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異進(jìn)行分析。
利用Gallery Plot 插件建立了12 份茶樣HSGC-IMS 譜圖中VOCs 的指紋圖譜(如圖1)。圖中從上到下分別為1-12 號樣品的有機(jī)物信號峰信息,每一行代表一個(gè)樣品,每個(gè)樣品平行測定3 次,由該樣品所含的全部揮發(fā)性有機(jī)物信號峰組成,每一列為同一保留時(shí)間及漂移時(shí)間下的有機(jī)物信號峰。
從圖1中VOCs 的離子峰排列可明顯看出,12 個(gè)曬青毛茶樣品中,平行測定的樣品組內(nèi)含有共有VOCs,即組內(nèi)樣品具有明顯的相似性,僅區(qū)別于濃度大??;由此也說明GC-IMS 儀器對樣品揮發(fā)性有機(jī)物信號響應(yīng)值具有很強(qiáng)的的穩(wěn)定性。不同茶葉樣品含有對應(yīng)時(shí)間內(nèi)所特有的VOCs,樣品組間則呈現(xiàn)出明顯的差異。即12 個(gè)茶葉樣品中有相似的揮發(fā)性香氣物質(zhì),也有不同種類和含量的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。圖1中橫排揮發(fā)性有機(jī)物信號峰可以看出各個(gè)茶葉樣品中所含有的揮發(fā)性有機(jī)物的種類,比較圖1中豎排信息,則可以看出12 份樣品中,所對應(yīng)的同種揮發(fā)性有機(jī)物在含量上的差異。
圖1 曬青毛茶樣品揮發(fā)性香氣化合物的指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of volatile compounds of sun-dried green tea samples
為了更加清晰地比較樣品間的差異,采用差異對比模式,將12 個(gè)茶葉樣品的二維圖譜繪制成差異圖譜(如圖2)。差異圖譜以1 號樣品的譜圖作為參比,剩余11 個(gè)樣品的譜圖扣減參比,圖2中白色區(qū)域表示二者揮發(fā)性有機(jī)物一致,扣減后沒有差異,紅色代表該物質(zhì)的濃度高于1 號茶樣,藍(lán)色代表該物質(zhì)的濃度低于1 號茶樣。
由圖2可知,12 份樣品得到揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的差異。如圖中“a 區(qū)域”黃色分布較廣,且顏色較深,說明2 號樣品的多種香氣物質(zhì)含量比1 號樣品高,“b 區(qū)域”的黃色和藍(lán)色都比較分散,且顏色很淺,說明3 號樣品與1 號樣品差異較小。“c 區(qū)域”藍(lán)色分布較廣,且顏色較深,說明11 號樣品的很多揮發(fā)性香氣含量物質(zhì)較1 號樣品低。
圖2 曬青毛茶樣品的GC-IMS 差異圖譜Fig.2 Differences fingerprint of volatile compounds in sun-dried green tea samples
為了定性比較12 份樣品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的相對差異,利用VOCal 插件處理數(shù)據(jù),得到12 份曬青毛茶樣品的離子遷移譜圖(如圖3為1 號樣品的離子遷移圖譜),圖中一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物,有機(jī)物的濃度由這些點(diǎn)的顏色深淺表示??v坐標(biāo)表示保留時(shí)間(s),橫坐標(biāo)表示遷移時(shí)間,紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰(RIP)。有的化合物有2 個(gè)斑點(diǎn),分別代表濃度和性質(zhì)不同的單體和二聚體。數(shù)字編號所代表的化合物名稱及相關(guān)信息見表2。
通過比較12 組樣品特征性風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間和遷移時(shí)間,使用外標(biāo)正酮 C4~C9作為參考標(biāo)準(zhǔn),校正得到各種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù),并繪制各揮發(fā)性香氣物質(zhì)信息表(表2),圖3種數(shù)字編號與表2種編號一一對應(yīng)。
結(jié)合圖2~圖3,表2可以看出12 份茶葉樣品的揮發(fā)性有機(jī)組分有明顯的差異。其中,老曼峨(3 號樣品)揮發(fā)性組分與曼囡曼班一隊(duì)茶樣(1 號樣品)揮發(fā)性組分相似,都是壬醛、辛醛、苯甲酸甲酯、1-辛烯-3-酮、1-己醇、2-乙基呋喃、2-乙基己醇等物質(zhì)的含量稍高;曼囡道坎茶樣(2 號樣品)的揮發(fā)性組分種類和濃度遠(yuǎn)高于曼囡曼班一隊(duì)茶樣(1 號樣品),主要表現(xiàn)在醛類(E-2-戊烯醛、癸醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、E-2-己烯醛、丁醛)、酮類(6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-丁酮)、酯類(2-苯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯)、醇類(芳樟醇、氧化芳樟醇)及烯類(檸檬烯、α-蒎烯)和3-甲基丁酸;曼邁河邊寨茶樣(5 號樣品)中苯乙酮、丁內(nèi)酯、1-戊醇乙酸等物質(zhì)的含量較高;曼金囡茶樣(6 號樣品)中醛類(2-十一烯醛、E-2-壬烯醛、E-2-辛烯醛)和2-乙酰基呋喃等物質(zhì)的含量較高;曼金曼開茶樣(7 號樣品)是醇類(1-辛烯-3-醇、甲醇)和酮類(2-庚酮、2-己酮)占優(yōu)勢。帕真茶樣(9 號樣品)中醛類(甲基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、糠醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛)揮發(fā)性有機(jī)組分含量極高;南糯石頭一隊(duì)(11 號樣品)中丁酸丁酯、2-甲基噻吩、乙酸乙酯、2-甲基丁醇、戊醛、丙酮、乙醇、二甲基硫醚等物質(zhì)的含量較高;南糯水河寨(12 號樣品)中香茅醇、β-羅勒烯、2-戊基呋喃等物質(zhì)的含量較高;曼囡新寨(4 號樣品)、曼邁(8 號樣品)與南糯新路茶樣的(10 號樣品)差異圖譜相似,都是醛類和酯類良種揮發(fā)性組分含量較高,主要是庚醛、己醛、丙酸丁酯、水楊酸甲酯、2-甲基己醛、乙酸丁酯、丙酸乙酯、3-甲基-1-戊醇等物質(zhì)的含量較高,曼囡新寨毛茶、曼邁曬青毛茶與南糯新路曬青毛茶來自于3 個(gè)不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn),曼邁與南糯新路地理位置很近,兩個(gè)樣品揮發(fā)性組分非常相似。但曼囡新寨(4 號樣品)、曼邁(8 號樣品)與南糯新路茶樣(10 號樣品)地理位置間隔很遠(yuǎn),卻有相似的揮發(fā)性組分,綜上可知,不同產(chǎn)區(qū)曬青毛茶揮發(fā)性組分在類別及含量上都有一定的差異。
圖3 1 號曬青毛茶樣品中揮發(fā)性化合物特征峰位置點(diǎn)Fig.3 Characteristic peak location point of volatile compounds in sun-dried green tea sample
表2 曬青毛茶樣品的揮發(fā)性組分信息Table 2 Sun-dried green tea samples’ volatile component informations
續(xù)表2
由圖4可知,本次試驗(yàn)的12 份曬青毛茶樣品可以分為兩大組,其中,曼囡新寨(4 號樣品)、曼邁(8 號樣品)與南糯新路茶樣(10 號樣品)為B 組,剩下的9 份樣品為A 組。兩組樣品的揮發(fā)性組分具有較大的差異,再次說明勐??h3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的曬青毛茶在揮發(fā)性有機(jī)組分之間沒有明顯的鄉(xiāng)鎮(zhèn)聚集性。
圖4 12 組樣品的PCA(主成分分析)圖Fig.4 Analylsis of PCA in 12 tea samples
西雙版納州勐??h格朗和鄉(xiāng)、布朗山鄉(xiāng)、勐宋鄉(xiāng)均是曬青毛茶的主要產(chǎn)地,三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)在地理位置上比較接近,由PCA 分析結(jié)果可知各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的曬青毛茶樣品沒有明顯的鄉(xiāng)鎮(zhèn)聚集性,每一個(gè)地區(qū)的茶都有特殊的揮發(fā)性組分物質(zhì),進(jìn)而形成勐??h“一山一味”的感官品質(zhì)特征。曬青毛茶的揮發(fā)性組分是多種物質(zhì)協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜體系,其種類及含量是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化的過程,前人研究認(rèn)為兒茶素類生化成分變異系數(shù)很高[30],會受茶樹品種、樹齡[26]、修剪方式[27]、加工工藝、儲存條件等多種因素影響。根據(jù)GC-IMS 結(jié)果可知,勐??h曬青毛茶樣品的主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)包括醇類、醛類、酮類、酯類、烯類、雜環(huán)類等,這與前人研究結(jié)果一致,但此次試驗(yàn)中檢出的醛類物質(zhì)種類高于醇類物質(zhì),可能是因?yàn)镚C-IMS技術(shù)對醛類物質(zhì)的檢測靈敏度極高,可以把不同性質(zhì)和濃度的單體和二聚體區(qū)分開來,也可能是因?yàn)楦鞣N檢測技術(shù)對揮發(fā)性組分的分類方法不一致導(dǎo)致。
本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)布朗山鄉(xiāng)曼囡道坎的茶樣醛、醇、酮、酯等揮發(fā)性組分種類和含量都很高,格朗和鄉(xiāng)帕真茶樣和勐宋鄉(xiāng)曼邁河邊寨茶樣的醛類物質(zhì)含量很高,而格朗和鄉(xiāng)南糯山石頭一隊(duì)的茶樣酯類揮發(fā)性組分很豐富,這些新發(fā)現(xiàn)為認(rèn)識和開發(fā)利用勐??h曬青毛茶資源提供了理論依據(jù)。此外,尚未發(fā)現(xiàn)其他學(xué)者采用GC-IMS 技術(shù)檢測勐??h的曬青毛茶揮發(fā)性香氣物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)說明使用GC-IMS 技術(shù),可以快速對茶葉樣品進(jìn)行分離鑒定,定性比較不同產(chǎn)地之間的樣品揮發(fā)性物質(zhì)差異。但是,本文只對樣品進(jìn)行了定性比較,對于各地區(qū)樣品不同揮發(fā)性香氣物質(zhì)的具體含量還需繼續(xù)探索。
通過本實(shí)驗(yàn)可知,來自于相同產(chǎn)地的曬青毛茶,其香氣物質(zhì)也有一定的差異。即便是非常著名的茶葉產(chǎn)地,其覆蓋范圍內(nèi)也有揮發(fā)性香氣物質(zhì)較差的茶葉,進(jìn)一步說明單純從茶葉產(chǎn)地來判斷茶葉品質(zhì)的好壞是不可行的。當(dāng)然,要全面判斷茶葉品質(zhì),需要從結(jié)合智能儀器和人體感官,從茶葉外形和內(nèi)質(zhì)(內(nèi)含成分、香氣、滋味)兩個(gè)方面分析,結(jié)合樣品的揮發(fā)性物質(zhì)具體含量綜合判斷,這也是課題組后期實(shí)驗(yàn)的方向。