王秀美 倪珊珊 李乾玉 李小芳 林爭(zhēng)春 陳裕坤 林玉玲 賴(lài)鐘雄 杜迎剛

摘 ?要：磷脂酶C（phospholipase C，PLC）廣泛參與植物的生命活動(dòng)和代謝過(guò)程，在抵御真菌感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究基于非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定出13個(gè)非洲菊PLC基因家族成員，其中NPC有3個(gè)，PI-PLC有10個(gè)。非洲菊PLC的蛋白序列長(zhǎng)度在98～594 aa之間，蛋白理論分子量為11 410.25～67 998.85 kDa，等電點(diǎn)為4.74～9.59，均為不穩(wěn)定親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，13個(gè)成員分別定位于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中，表明不同成員功能上可能存在多樣性。進(jìn)化樹(shù)分析表明，13個(gè)非洲菊PLC蛋白可分為2個(gè)亞組，進(jìn)化關(guān)系較近的蛋白結(jié)構(gòu)組成相似。非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白PLC2、PLC4、AT2G40116可相互作用。非洲菊轉(zhuǎn)錄組的FPKM值分析表明，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10在非洲菊中表達(dá)量高，感病植株中變化大，可能在抵御真菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究非洲菊PLC基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：非洲菊;磷脂酶C;基因家族;進(jìn)化分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Phospholipase C （PLC） is widely involved in the life activities and metabolism processes of plants， and plays an important role in the process of resisting fungal infection. Based on the results of the transcriptome sequencing in Gerbera jamesonii， 13 members of G. jamesonii PLC gene family， including 3 NPC and 10 PI-PLC were identified in the study. The sequences of G. jamesonii PLC proteins ranged from 98 to 594 aa in length， theoretical molecular weight varied from 11 410.25 to 67 998.85 kDa， isoelectric point in the range of 4.74 to 9.59， and all were unstable hydrophilic proteins. The prediction results of subcellular localization showed that the 13 members were located in the cell wall， cell membrane， cytoplasm， chloroplast and nucleus， indicating that there might be diversity in functions of different mem-bers. Evolutionary trees analysis showed that 13 PLC proteins of G. jamesonii were divided into two subgroups， the structure and composition of proteins with relatively close evolutionary relationship were similar. G. jamesoniis homo-logous protein PLC2， PLC4 and AT2G40116 in Arabidopsis thaliana can interact with each other. The FPKM value analysis of G. jamesonii transcription showed that GjPLC2， GjPLC3， GjPLC8 and GjPLC10 were highly expressed in G. jamesonii and changed greatly in infected plants， which may play an important role in preventing fungal infection. These results could provide the basis for further study of the biological function of G. jamesonii PLC genes.

Keywords： Gerbera jamesonii Bolus; Phospholipase C; gene family; evolutionary analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.010

磷脂酶C（phospholipase C，PLC）是一種普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中的脂質(zhì)水解酶，根據(jù)作用底物的不同可主要分為磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC，PI-PLC）和非特異性磷脂酶C（non-specific PLC，NPC）[1-2]。PI-PLC蛋白由N端的EF手型結(jié)構(gòu)域、C端的C2結(jié)構(gòu)域及中間的X、Y結(jié)構(gòu)域組成[2]，主要水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidyfinositol4， 5-bisphosphate，PIP2），生成水溶性三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和脂溶性二酰甘油（diacylglycerol，DAG）[3]。而NPC蛋白只包含一個(gè)具有磷脂酶活性的磷酸酯酶區(qū)，主要水解磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG），生成DAG和相應(yīng)磷酸鹽[4]。

研究表明，由PI-PLC蛋白水解產(chǎn)生的IP3進(jìn)入細(xì)胞液后能觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+存儲(chǔ)庫(kù)釋放Ca2+，進(jìn)而誘發(fā)一系列生理生化反應(yīng);進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后則會(huì)經(jīng)過(guò)多磷酸肌醇激酶（Inositol polyphosphate kinase，IPK2/IPMK）逐級(jí)磷酸化形成六磷酸肌醇（inositol hexaphosphate，IP6），IP6作為信號(hào)分子促進(jìn)Ca2+釋放，參與植物對(duì)病原菌脅迫的應(yīng)答[5]。由PI-PLC和NPC蛋白水解產(chǎn)生的DAG在甘油二酯激酶（diacylglycerol Kinase，DGK）的催化作用下迅速磷酸化生成磷脂酸（phosphatidicacid，PA），并通過(guò)與一些蛋白激酶、脂激酶和NADPH氧化酶等之間的相互作用，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長(zhǎng)、非生物脅迫和細(xì)胞死亡等生理過(guò)程[6]。因此，PLC基因可以參與植物細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)和分化以及細(xì)胞的免疫等諸多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。例如，在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtPLC5會(huì)引起擬南芥和煙草葉片早衰[7];下調(diào)番茄SlPLC4和SlPLC2表達(dá)水平則損害其對(duì)葉霉病菌[8]、灰霉病[9]以及真菌誘導(dǎo)的木聚糖酶[10]的免疫功能。

非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）是世界五大鮮切花之一[11]，原產(chǎn)于非洲南部的德蘭士瓦，具有花朵大、色彩艷麗、花期長(zhǎng)、切花產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作切花和盆栽觀賞。但根腐病的泛濫嚴(yán)重限制了非洲菊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，由隱地疫霉（Phytophthora cryptogea）引起的根腐病一般情況下的發(fā)病率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上[12]，因此，選育優(yōu)良的非洲菊抗病品種是生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。目前，關(guān)于非洲菊的PLC基因研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究基于非洲菊健康植株和感染根腐病病原菌植株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)PLC基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究非洲菊PLC基因的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

非洲菊（健康植株和感染根腐病病原菌植株）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本實(shí)驗(yàn)室課題組測(cè)序獲得（SRA：SRR9937065），模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的PLC家族蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org），水稻（Oryza sative L.）的PLC家族蛋白序列下載自RiceData數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ricedata.cn/gene）和NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?非洲菊PLC基因家族的鑒定 ?利用NCBI的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）將非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選，得到PLC家族相關(guān)蛋白序列。利用在線(xiàn)軟件HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART（http：//smart. embl-heidelberg.de/）對(duì)其蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域逐個(gè)進(jìn)行鑒定分析，去除掉重復(fù)和不含有PLC家族特征結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2.2 ?非洲菊PLC家族蛋白序列分析 ?利用在線(xiàn)軟件ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl）、Plant- mPLocServer（http：//www.Csbio. sjtu.edu.cn/bioin- f/plant-multi）分析預(yù)測(cè)非洲菊PLC蛋白序列的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行及亞細(xì)胞定位。利用在線(xiàn)軟件MEME Suite 5.1.1（http：// meme-suite.org/tools/meme）分析非洲菊PLC家族蛋白的保守基序，設(shè)置基序數(shù)目為30。

1.2.3 ?非洲菊PLC家族蛋白序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 ?利用多序列對(duì)比軟件Clustalx對(duì)鑒定得到的非洲菊PLC蛋白序列與擬南芥、水稻的PLC蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法，Bootstrap設(shè)為1000，其他參數(shù)為默認(rèn)值下建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并使用在線(xiàn)軟件iTOL（https：// itol.embl.de/upload.cgi）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化。

1.2.4 ?非洲菊PLC家族蛋白互作分析 ?將非洲菊PLC蛋白序列導(dǎo)入在線(xiàn)軟件STRING（https：// string-db.org/），以模式植物擬南芥為參考序列構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白的互作關(guān)系。

1.2.5 ?非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中差異表達(dá)的FPKM值分析 ?利用非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析PLC基因在健康和感病植株中的差異表達(dá)。以非洲菊健康植株和感病植株每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的reads（reads per ki-lobase of exon model per million mapped reads，F(xiàn)PKM）為基因轉(zhuǎn)錄豐度，利用Heml軟件做熱圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?非洲菊PLC家族基因的鑒定

基于本課題組前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用NCBI的BLAST初步篩選得到23條PLC家族相關(guān)的蛋白序列。PI-PLC蛋白包含EF手型結(jié)構(gòu)域、X結(jié)構(gòu)域、Y結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域，而NPC蛋白中只含有一個(gè)磷酸酯酶區(qū)，通過(guò)HMMER和SMART對(duì)其蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行篩選，去除掉重復(fù)和不含有PLC家族特征結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到13條非洲菊PLC蛋白序列（表1）。其中NPC有3條，PI-PLC有10條。為方便研究，根據(jù)PLC基因的種類(lèi)和轉(zhuǎn)錄組基因ID的大小統(tǒng)一非洲菊PLC基因編號(hào)（GjNPC1～ GjNPC3，GjPLC1～GjPLC10）。

2.2 ?非洲菊PLC家族蛋白序列分析

通過(guò)PLC蛋白序列的理化性質(zhì)分析（表2），發(fā)現(xiàn)非洲菊PLC蛋白序列的長(zhǎng)度在98～594 aa之間，預(yù)測(cè)蛋白理論分子量為11 410.25～ 67 998.85 kDa，等電點(diǎn)為4.74～9.59。預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)小于7的酸性蛋白有7個(gè)，大于7的堿性蛋白有6個(gè)。所有蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)都大于40，表明它們均為不穩(wěn)定蛋白;平均親水系數(shù)都為負(fù)值，表明他們均為親水蛋白。

通過(guò)在線(xiàn)軟件SOPMA分析預(yù)測(cè)非洲菊PLC蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表3），發(fā)現(xiàn)非洲菊PLC家族蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最高，除了GPLC1，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例最低。在NPC中所有α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例都高于延伸鏈結(jié)構(gòu)，PI-PLC中則有7個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例高于延伸鏈結(jié)構(gòu)。

通過(guò)在線(xiàn)軟件Plant-mPLoc Server分析預(yù)測(cè)非洲菊PLC蛋白序列的亞細(xì)胞定位（表3），發(fā)現(xiàn)13個(gè)非洲菊PLC蛋白在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中均有定位。其中，GjNPC1定位于細(xì)胞壁，GjNPC2、GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8定位于細(xì)胞膜，GjNPC3定位于細(xì)胞壁和葉綠體，GjPLC1與GjPLC9定位于細(xì)胞質(zhì)，GjPLC2與GjPLC10定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，GjPLC6定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。

利用在線(xiàn)軟件MEME對(duì)非洲菊的PLC家族蛋白保守基序進(jìn)行分析，本研究共預(yù)測(cè)分析了30個(gè)保守基序（圖1）。發(fā)現(xiàn)在13個(gè)非洲菊PLC蛋白序列中，motif4、motif9、motif13、motif1、motif17相連的基序可能為磷酸酯酶區(qū)，motif21、motif25、motif23、motif3、motif14、motif5、motif16和motif27、motif30、motif26相連的基序可能為X結(jié)構(gòu)域，motif12、motif11、motif2、motif15相連的基序可能為Y結(jié)構(gòu)域，motif8、motif10、motif6相連的基序可能為C2結(jié)構(gòu)域。

上述結(jié)果表明，非洲菊PLC蛋白無(wú)論在理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、還是亞細(xì)胞定位方面都有較大的差異，暗示非洲菊PLC基因具有不同生物學(xué)特征。

2.3 ?非洲菊PLC家族蛋白的進(jìn)化分析

由圖2可知，13個(gè)非洲菊PLC蛋白成員可以分為GroupⅠ、GroupⅡ2個(gè)亞組，其中3個(gè)NPC蛋白分布在GroupI中，10個(gè)PI-PLC蛋白分布在GroupⅡ中。GroupⅡ分為a、b、c 3部分，GroupⅡa中有2個(gè)非洲菊PLC成員（GjPLC1、GjPLC9）和3個(gè)水稻PLC成員（OsPLC1、OsPLC2、OsPLC3）;GroupⅡb中有4個(gè)非洲菊PLC成員（GjPLC2、GjPLC5、GjPLC8、GjPLC10）、4個(gè)擬南芥PLC成員（AtPLC1、AtPLC2、AtPLC3、AtPLC7）和1個(gè)水稻PLC成員（OsPLC4）;Group IIc中有4個(gè)非洲菊PLC成員（GjPLC3、GjPLC4、GjPLC6、GjPLC7）和4個(gè)擬南芥PLC成員（AtPLC4、AtPLC5、AtPLC8、AtPLC9）。非洲菊PLC蛋白與雙子葉植物擬南芥在進(jìn)化上親緣較關(guān)系較近，與單子葉植物水稻關(guān)系較遠(yuǎn)，且進(jìn)化關(guān)系較近的非洲菊PLC蛋白結(jié)構(gòu)組成相似，可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.4 ?非洲菊PLC家族蛋白互作分析

非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白的互作關(guān)系預(yù)測(cè)分析顯示（表4、圖3），13個(gè)非洲菊PLC家族成員在擬南芥中同源性較高的蛋白有7個(gè)，分別為NPC1、NPC3、NPC6、PLC2、PLC4、AT2G40116、AT4G38690。其中，NPC1、NPC3、NPC6可以共存并相互結(jié)合，NPC1、PLC2可以共同表達(dá)，PLC2、PLC4、AT2G40116可以相互結(jié)合、催化并產(chǎn)生反應(yīng)。表明擬南芥的PLC2、PLC4、AT2G40116蛋白家族成員可相互作用，而與其同源性較高的非洲菊蛋白家族成員GjPLC1、GjPLC2、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8、GjPLC9、GjPLC10是否可以相互作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 ?非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中差異表達(dá)的FPKM值分析

從圖4可知，在非洲菊健康和感病植株中，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10的表達(dá)量較高，GjNPC1、GjNPC3、GjPLC1、GjPLC6、GjPLC7、GjPLC9表達(dá)量較低。與健康植株相比，GjNPC2、GjPLC1、GjPLC2、GjPLC6、GjPLC10在感病植株中上調(diào)，其中GjPLC2、GjPLC10上調(diào)量較高;GjNPC1、GjNPC3、GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8、GjPLC9在感病植株中下調(diào)，其中GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC8下調(diào)量較高。GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10在非洲菊中表達(dá)量高，且與健康植株相比，感病植株中的表達(dá)量變化大，推測(cè)其在抵御真菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

3 ?討論

3.1 ?非洲菊PLC基因家族成員多且可能具有不同的生物學(xué)功能

自1980年Irvine等[13]得到一種能分解磷脂酰肌醇的PLC后，水稻和擬南芥等模式植物中PLC相繼被人們克隆了出來(lái)，近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的PLC基因家族在多種不同的植物中被預(yù)測(cè)或鑒定出來(lái)，其中，擬南芥[14]中有14個(gè)（9個(gè)PI-PLC，5個(gè)NPC），水稻[15]中有9個(gè)（4個(gè)PI-PLC，5個(gè)NPC），棉花[16]中有15個(gè)（9個(gè)PI-PLC，6個(gè)NPC），亞麻芥[17]中有10個(gè)，玉米[18]中有9個(gè)、蓖麻[19]中有6個(gè);楊樹(shù)[20]、蘭花[21]、桃[22]中只鑒定出PI-PLC，分別有7個(gè)、3個(gè)、5個(gè)。本研究基于實(shí)驗(yàn)室課題組獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定出13個(gè)非洲菊PLC基因，其中NPC有3個(gè)，PI-PLC有10個(gè)。

本研究對(duì)非洲菊PLC蛋白序列的亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核中均有定位，且大部分位于細(xì)胞膜，這正好符合了Hong等[2]證實(shí)的大部分PLC定位在細(xì)胞膜上的結(jié)論。對(duì)非洲菊PLC家族的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NPC只包含一個(gè)磷酸酯酶區(qū)，PI-PLC則含有EF手型結(jié)構(gòu)域、X結(jié)構(gòu)域、Y結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域4個(gè)結(jié)構(gòu)域，這與模式植物擬南芥[14]和水稻[15]的保守結(jié)構(gòu)相同。對(duì)非洲菊分子進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)非洲菊PLC蛋白可分為2個(gè)大亞組，GroupⅠ為NPC，GroupⅡ?yàn)镻I-PLC，其中GroupⅡ分為a、b、c 3個(gè)小亞組，進(jìn)化關(guān)系較近的非洲菊PLC蛋白結(jié)構(gòu)組成相似，可能具有相似的生物學(xué)功能。另外，對(duì)非洲菊PLC蛋白序列的分析，發(fā)現(xiàn)這13個(gè)蛋白在理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面有較大的差異，表明非洲菊PLC基因可能具有不同生物學(xué)特性和功能。

3.2 ?非洲菊PLC基因家族可能參與植物免疫反應(yīng)

越來(lái)越多的研究表明，磷脂酶C在植物先天免疫反應(yīng)中起核心作用，可參與植物生物脅迫的適應(yīng)過(guò)程[23]，例如水稻[24-25]中的OsPI-PLC1在病原菌脅迫下，可通過(guò)Ca2+信號(hào)通路參與植物抗病反應(yīng);擬南芥[26]感染病菌后AtPLC5蛋白可以參與信號(hào)脅迫傳導(dǎo)過(guò)程，增強(qiáng)抵御病原菌入侵能力;煙草[27]中的NtPLC4過(guò)量表達(dá)后，煙草植株抗病性顯著提高等。本研究利用非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中的FPKM值，分析非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與健康植株相比，感病植株中有5個(gè)基因上調(diào)，8個(gè)基因下調(diào)。其中，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10的表達(dá)量高，表達(dá)量變化大，推測(cè)其在抵御真菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

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