黃云先 趙健勝 曹云蕓

【摘 要】 目的：對《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊滇老鸛草標(biāo)準(zhǔn)中鑒別方法改進(jìn)。方法：用顯微及專屬性強(qiáng)的沒食子酸對照品TLC薄層色譜鑒別。結(jié)果：顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強(qiáng)、操作簡便、而特異性較強(qiáng)，薄層鑒別引進(jìn)代表性成份沒食子酸對照品進(jìn)行定性。結(jié)論：改進(jìn)方法簡便、快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于滇老鸛草藥材的鑒別及質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 滇老鸛草;TLC鑒別;沒食子酸;顯微鑒別

【中圖分類號】R284 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）09-0044-04

Abstract：Objective To improve the identification method of Geranium nepalense Sweet in the second volume of the standard of yunnan Chinese medicine decoction piece （2005 edition） Method Method with microscopic and and specific reference substance Gallic acid was identified by TLC.Result Microscopic identification as a way to identify traditional Chinese medicine， proprietary Chinese medicine， one of its methods variability is not strong， easy to operate， and the specificity is stronger， The reference substance of gallic acid was introduced into TLC for qualitative analysis.Conclusion The improved method is simple， rapid， accurate， specific and reproducible， and can be used for the identification and quality control of Geranium nepalense Sweet.

Keywords：Geranium Yunnanensis; Tlc Identification; Gallic Acid; Microscopic Identification

滇老鸛草來源于牻牛兒苗科植物滇老鸛草Geranium nepalense Sweet干燥地上部分。別名老鸛草、五葉草、老官草、六陽草、五瓣草、貓腳跡、老觀草[1]、尼泊爾老鸛草[2]。老鸛草來源于牻牛兒苗科的兩屬植物，即牻牛兒苗屬和老鸛草屬的不同植物[4]。牻牛兒苗屬植物我國約有四種，老鸛草屬植物我國約有55種，云南省約產(chǎn)21種。《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊收載的滇老鸛草為尼泊爾老鸛草Geranium ?nepalense ?Sweet。老鸛草屬植物全草富含老鸛草鞣質(zhì)，干葉含老鸛草鞣質(zhì)、金絲桃苷，又含類沒食子酸、琥珀酸、鈣鹽、甜菜堿[3]、黃酮類槲皮素、山奈酚[2]等，《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊·彝族藥中對滇老鸛草的鑒別對照藥材薄層色譜鑒別，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]，通過對云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣5個(gè)批次的滇老鸛草樣品做了顯微鑒別及專屬性較強(qiáng)的成分沒食子酸的薄層色譜鑒別，以建立一個(gè)專屬性更強(qiáng)的鑒別方法，從而達(dá)到控制滇老鸛草藥材質(zhì)量的目的。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 德國塞多利斯BT224S電子分析天平;梅特勒MS205DU電子分析天平;Purelab Flex 超純水機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 試藥試劑 沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201906）;老鸛草對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121557-201102）;三氯甲烷、甲酸乙酯 、甲酸、甲醇、、乙醇、乙酸乙酯環(huán)己烷、丙酮、正丁醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;水（實(shí)驗(yàn)室自制UP水，Ω=18.3）; 硅膠GF254薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（美國莫克）。

1.2.2 樣品來源 采集麗江市玉龍縣、古城區(qū)不同五個(gè)地方的樣品共5個(gè)：

D1. 2015年9月，采收于麗江市玉龍縣白沙鄉(xiāng)玉湖村，為野生品種;為干燥地上部分。標(biāo)本為全株（大樣）。

D2. 2015年6月，采收于麗江市古城區(qū)祥云街道辦事處吉祥社區(qū)，為野生品種;為干燥地上部分。

D3. 2015年9月，采收于麗江市玉龍縣黎明鄉(xiāng)黎明村，為野生品種;為干燥地上部分。標(biāo)本為全株（溯源小樣）。

D4. 2015年7月，采收于麗江市玉龍縣拉市鄉(xiāng)，為野生品種;為干燥地上部分。

D5. 2015年5月，采收于古城區(qū)束河街道辦開文社區(qū)九子海，為野生品種;為干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別（改進(jìn)自擬方法） 本品莖橫切面 ? 表皮由2～3列薄壁細(xì)胞組成，皮層為數(shù)列細(xì)胞，內(nèi)側(cè)厚壁細(xì)胞環(huán)明顯，維管束8～9個(gè)，外韌型，呈輻射狀排列;形成層不明顯，韌皮部寬廣，木質(zhì)部狹小，導(dǎo)管散列其中。薄壁細(xì)胞中草酸鈣簇晶眾多。

粉末顯微特征：本品粉末灰綠色。草酸鈣簇晶眾多而小，直徑10～20 μm。氣孔多為不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)。非腺毛1～4細(xì)胞，基部細(xì)胞稍寬，尖端較長;腺毛短小，頭部圓形或橢圓形，腺柄1～4個(gè)細(xì)胞組成。螺紋導(dǎo)管多見;可見淀粉粒，多為單粒球形散在。見粉末顯微圖2A～F。

2.2 薄層鑒別（改進(jìn)自擬方法） 取本品LO1到LO5號粉末（過四號篩）1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取三次，每次20 mL，取乙酸乙酯液水?。?0 ℃）上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取滇老鸛草對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》第四部附錄試驗(yàn)，分別吸取上述兩種溶液各5 μL和10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯 –甲酸（5∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)色的斑點(diǎn)。不同點(diǎn)樣量的薄層圖如圖3所示。

3 分析方法驗(yàn)證

3.1 樣品溶液制備試驗(yàn)篩選 方法1：分別取本品粉末0.3 g和0.5 g（過四號篩），加甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法2：分別取本品粉末0.3 g和0.5 g（過四號篩），加乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法3：取本品粉末0.5 g，加70%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法4：取本品粉末0.5 g，加70%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法5：取本品粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法6：取本品粉末0.5 g，加50%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法7：取本品粉末0.5 g，加30%甲醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法8：取本品粉末0.5 g，加30%乙醇20 mL，處理步驟同方法1。

方法9：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法10：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法11：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

方法12：分別取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加熱煎煮30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。作為供試品溶液。

通過實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方法9操作可行性高，分離效果良好，方法驗(yàn)證效果良好，決定選用方法9中取1 g的方法為最終供試品制備方法。

3.2 展開劑篩選 展開劑1：乙酸乙酯-甲醇 –水（8∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.2）;

展開劑2：乙酸乙酯-甲醇 –水（8∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]2）的下層溶液;

展開劑3：三氯甲烷-甲醇-水（8∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.2）;

展開劑4：環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]1）;

展開劑5：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶[KG-*3/5]4∶[KG-*3/5]1）;

展開劑6：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.8）;

展開劑7：甲苯（水飽和）-甲酸乙酯-甲酸（10∶[KG-*3/5]8∶[KG-*3/5]1）;

展開劑8：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1）;

展開劑9：正己烷-甲醇（1∶[KG-*3/5] 9） ;

展開劑10：正己烷-乙酸乙酯（1∶[KG-*3/5]4）。

飽和10 min，上行展開。

通過比對用展開劑6號展開時(shí)RF值為0.37，在0.2～0.8藥典規(guī)定的范圍，展開效果好。

3.3 檢視方法的選擇 噴以10%磷鉬酸顯色;噴以2%三氯化鐵50%的乙醇溶液;噴以5%氯化鐵乙醇液;紫外光燈（365 nm）下檢視;噴以5%三氯化鐵乙醇液，再在紫外光燈（365 nm）下檢視。選用上述5種方法檢視，第三種斑點(diǎn)清晰且方法簡便。

3.4 點(diǎn)樣方式及點(diǎn)樣量考察 點(diǎn)樣方式為接觸點(diǎn)樣;點(diǎn)樣量為2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。溫度及相對濕度的影響 ?按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察本品在溫度5～30 ℃、相對濕度10%～75%展開時(shí)，對薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述溫度、濕度范圍內(nèi)對該薄層色譜結(jié)果無明顯影響，點(diǎn)樣量為10 μL斑點(diǎn)效果好。

3.5 預(yù)平衡試驗(yàn) 按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展開，對薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，未平衡的展開邊緣效應(yīng)較明顯，平衡15 min與平衡30 min展開，所得分離度均較好，且無明顯差異。因此采用預(yù)平衡15 min展開。

3.6 重復(fù)性 不同產(chǎn)地的5批次樣品的檢測結(jié)果表明，該方法具有重復(fù)性。

4 討論

4.1 顯微鑒別方法建立 顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強(qiáng)、操作簡便、而特異性較強(qiáng)，可以說利用顯微特征對比鑒定對大多數(shù)中藥材都行之有效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，滇老鸛草也不例外，的確具有其顯著的特異性。

4.2 引進(jìn)代表性對照品 民族藥標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)階段整體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平較低，仍多集中于藥材基源及性狀鑒定的研究，尚未建立指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制，原標(biāo)準(zhǔn)未引進(jìn)代表性對照品進(jìn)行定性。通過大量查找資料，考慮滇老鸛草的傳統(tǒng)主要功效為止瀉止血，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，老鸛草屬植物主要含鞣質(zhì)類沒食子酸、黃酮類槲皮素、山奈酚等，故考慮引進(jìn)沒食子酸作為其代表性成分研究制定薄層色譜鑒別方法。

4.3 薄層鑒別方法建立 依據(jù)沒食子酸易溶于水、醇和醚;具有酚（易被氧化和三氯化鐵水溶液生成藍(lán)黑色沉淀）及羧酸（加熱時(shí)失去二氧化碳成焦性沒食子酸）的性質(zhì)。試驗(yàn)考察了采用不同取樣量，選用水及不同比例的甲醇和乙醇采用超聲、加熱煎煮及回流提取方法，跟著考察了水提的提取液再用不同的有機(jī)溶劑乙酸乙酯、正丁醇及水飽和正丁醇提取的多種方法做對比，最終實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證采用方法9提取效果較好，能有效的提出沒食子酸。

展開劑的選擇在使用不引入甲酸的展開劑如1～4號及9號10號展開時(shí)，有的在原點(diǎn)形成堆積或展開不上去，用7號及8號展開劑展開，結(jié)果斑點(diǎn)不太清晰，5號和6號展開劑的選擇參考了《中國藥典》2015版中五倍子中鞣質(zhì)類成分沒食子酸薄層鑒別方法中的三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]1，V/V/V）。實(shí)驗(yàn)考察了展開劑中甲酸比例對展開效果的影響，結(jié)果是6號展開劑三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.8，V/V/V）展開能使沒食子酸處于游離狀態(tài)，斑點(diǎn)分離效果好，Rf值適中，且無拖尾現(xiàn)象。

最終采用方法9制備供試品溶液，硅膠G薄層板，點(diǎn)樣量10 μL，以展開劑6號15 mL為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇液，所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，易判斷結(jié)果，且重現(xiàn)性好。

5 結(jié)論

此次實(shí)驗(yàn)新擬的顯微鑒別方法操作簡便、特異性強(qiáng)，建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加顯微鑒別。薄層色譜條件可行有效，原標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項(xiàng)下未引進(jìn)代表性對照品進(jìn)行定性，考慮引進(jìn)沒食子酸作為其代表性成分，建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加現(xiàn)擬方法，應(yīng)與沒食子酸對照品及滇老鸛草對照藥材色譜相同?？梢娨詻]食子酸作為滇老鸛草藥材標(biāo)識性成分有其合理性?？捎糜诘崂消X草藥材的質(zhì)量控制，以提高民族藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也可用于制定滇老鸛草對照藥材標(biāo)準(zhǔn)研制的起草。

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（收稿日期：2020-10-14 編輯：程鵬飛）