櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠高脂膳食誘導(dǎo)肥胖的預(yù)防作用

吐克孜·吾守爾，王 茹，張姣姣，黃偉偉，李艷紅

隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖人群逐年增加，并呈年輕化趨勢(shì)，肥胖癥常伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，如高血壓、高血脂及糖尿病等[1]。高脂血癥是心腦血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化以及脂肪肝等疾病的危險(xiǎn)因素之一。現(xiàn)有的治療肥胖方法大都存在降低機(jī)體免疫力、毒副作用大、易反彈等缺點(diǎn)。開(kāi)發(fā)利用天然無(wú)毒的功能性食品防治高血脂，成為防止高血脂發(fā)生的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)[2]。

櫻桃李（Prunus cerasifera Ehrh.） 俗稱(chēng)野酸梅，薔薇科李屬，落葉灌木或小喬木，生長(zhǎng)于新疆伊犁海拔1 100～1 600 m 的山坡林或多石礫的坡地以及峽谷水邊等處的原始野生林，是世界上稀有而珍貴的天然綠色食品原料[3-4]。由于放牧、人工砍伐及氣候變化等因素，目前新疆野生櫻桃李已瀕危滅絕，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)物種和自治區(qū)Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)物種[5]。有研究報(bào)道，櫻桃李果實(shí)中含多種營(yíng)養(yǎng)成分，是難得的天然保健食品[6]。當(dāng)?shù)鼐用癯Ｓ脕?lái)制作果醬或曬干后泡茶。有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期食用櫻桃李對(duì)當(dāng)?shù)卮罅渴秤门?、羊肉牧民的高血脂、高血壓等很有效，被人們譽(yù)為“雪域珍果”[7-8]。

目前，在動(dòng)物水平上對(duì)櫻桃李果實(shí)功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以新疆伊犁地區(qū)野生櫻桃李為材料，提取果皮及果肉水溶性總成分，研究其對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠的降脂功能，為深入探究櫻桃李果實(shí)功效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 紫果櫻桃李，2017年8月購(gòu)自新疆伊犁霍城縣大西溝。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠動(dòng)物合格證號(hào)【SCXK（新）2018-0018】48 只，體重18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 試劑 DPPH，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；沒(méi)食子酸，北京索萊寶科技有限公司；低脂純化飼料MD10%FAT、高脂純化飼料MD45%FAT，常州開(kāi)源動(dòng)物飼料有限公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）含量測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程有限公司；Trizol、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒，天根生化科技北京有限公司。

1.1.4 設(shè)備與儀器 JXFSTPRP-CL 冷凍研磨儀，上海凈信公司；5804R 低溫高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；sunrise-basic 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；721 可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海尤尼科公司；DYY-8C 型電泳儀，北京六一儀器廠；熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI Stepone；微量核酸蛋白檢測(cè)儀，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 櫻桃李果實(shí)提取物的制備 取新鮮的櫻桃李榨汁1.0 kg，10 000 g 離心60 min，取上清，補(bǔ)充雙蒸水至1 L，得到果實(shí)粗提物，分裝后存于-80℃冰箱，備用。

1.2.2 櫻桃李提取物多酚含量的測(cè)定 采用福林酚法[9]測(cè)定果實(shí)多酚含量，以沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)物線，在波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物和樣品吸光度，計(jì)算待測(cè)樣品中酚類(lèi)物質(zhì)的總含量。

1.2.3 提取物抗氧化活性的測(cè)定 通過(guò)測(cè)定DPPH 自由基清除能力[8]，確定提取物體外抗氧化活性。在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物和樣品吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

DPPH 自由基清除率（%）=A0-（As-Ac）/A0×100

式中：A0——水+DPPH 的吸光度；AS——樣品溶液+DPPH 的吸光度；AC——樣品溶液+乙醇的吸光度。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組 48 只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為4 組，分別為普通對(duì)照組（CK，普通飼料）、低脂對(duì)照組（LFD，MD 10%）、高脂對(duì)照組（HFD，MD 45%）、櫻桃李果汁組（CJD，MD 45%）[10]。CK、LFD、HFD 小鼠正常飲水、進(jìn)食，CJD 小鼠飲用櫻桃李果實(shí)提取物，每籠6只，動(dòng)物房溫度控制在（22±2）℃，濕度30%，實(shí)驗(yàn)周期為10 周，每周稱(chēng)重，每3 d 記錄攝食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食24 h，稱(chēng)重，摘眼球取血，解剖，快速取肝臟，置于-80 ℃冰箱中貯存，備用。

1.2.5 生化指標(biāo)的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定小鼠血清中TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C、SOD、AKP、AST/GOT、ALT/GPT 含量以及小鼠肝臟組織TG、T-CHO 的含量。

1.2.6 熒光定量PCR 檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 用Trizol 法提取肝臟總RNA，用隨機(jī)引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和SYBR GREEN 染料法，以β-actin 為內(nèi)參基因，定量檢測(cè)小鼠肝臟組織PPARγ、FAS、SREBP-1c、C/EBP-α 的表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR 檢測(cè)基因的引物序列Table 1 Primer sequences used in the real-time PCR assays

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，組間比較用方差分析和t 檢驗(yàn)，P<0.05表示存在顯著性差異。采用SigmaPlot12.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃李果實(shí)提取物的多酚含量

以波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸?；貧w方程為y=0.0043x+0.0071，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。通過(guò)計(jì)算得到櫻桃李提取物中多酚含量為105.74 mg/g。

2.2 櫻桃李果實(shí)提取物的抗氧化活性

以波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，DPPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸，得到回歸方程為y=0.711x+0.0668，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9899。通過(guò)計(jì)算得到櫻桃李提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率為81.07%，說(shuō)明其具有較高的體外抗氧化活性。

2.3 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)高脂膳食小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周測(cè)定小鼠體重1 次。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第2 周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，在同一時(shí)間測(cè)定，HFD 組小鼠體重明顯高于其它組（P＜0.05），CJD 組小鼠體重與CK 組相比不存在顯著性差異（P＞0.05）（圖1），說(shuō)明櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)高脂膳食小鼠有明顯的減重作用。

圖1 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 Effects of Prunus cerasifera Ehrh.extract on weight of mice

2.4 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠血清TG、TCHO、HDL-C 和LDL-C 的影響

高脂飼料處理10 周后，HFD 組小鼠血清中TG、T-CHO、HDL-C 和LDL-C 含量均明顯升高。CJD 組TG、T-CHO 與HFD 組比較顯著降低（P<0.05），與CK 組比較不存在顯著性差異（圖2a、2b）。CJD 組HDL-C、LDL-C 與HFD 組及CK、LFD組比較均不存在顯著差異（P>0.05）（圖2c、2d），說(shuō)明櫻桃李果實(shí)提取物可顯著降低高脂膳食誘發(fā)的小鼠血清中甘油三酯和總膽固醇的含量，對(duì)高脂膳食小鼠血清中高、低密度脂蛋白含量無(wú)顯著影響。

圖2 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠血清TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C 含量的影響Fig.2 Effects of Prunus cerasifera Ehrh.extract on TG，T-CHO，HDL-C，LDL-C in serum of mice

2.5 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠血清SOD 的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定各組小鼠血清中SOD 的含量，結(jié)果顯示，CJD 組SOD 含量顯著升高，與CK、HFD、LFD 組相比，均存在顯著性差異（P<0.05）；HFD、LFD 組均顯著低于CK 組（P<0.05），說(shuō)明櫻桃李果實(shí)提取物能顯著提高機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力，即提高機(jī)體的抗氧化活性。

圖3 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠血清SOD 的影響Fig.3 Effects of Prunus cerasifera Ehrh.extract on SOD in serum of mice

2.6 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠血清AKP、ALT/GPT、AST/GOT 的影響

為檢測(cè)櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠肝臟損傷的作用，測(cè)定小鼠血清中AKP、ALT/GPT、AST/GOT的含量，結(jié)果顯示，HFD 組小鼠血清AKP、ALT/GPT、AST/GOT 含量顯著高于其它組（圖4）。CJD組AKP、AST/GOT 雖略高于CK 組，但不存在顯著性差異（圖4a、4c）。CJD 組ALT/GPT 高于CK 組，存在顯著性差異（P<0.05）（圖4b），說(shuō)明攝入高脂食物對(duì)小鼠肝臟有一定的損傷作用，櫻桃李果實(shí)提取物能顯著抑制高脂食物對(duì)小鼠肝臟的損傷。

圖4 櫻桃李提取物對(duì)小鼠血清AKP、ALT/GPT、AST/GOT 的影響Fig.4 Effect of Prunus cerasifera Ehrh.extract on AKP、ALT/GPT、AST/GOT in serum of mice

2.7 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)小鼠肝臟TG、T-CHO的影響

高脂飼料飼養(yǎng)10 周后，小鼠肝臟中TG 和TCHO 含量顯著升高，櫻桃李果實(shí)提取物組小鼠肝臟TG 和T-CHO 含量與HFD 組相比顯著降低（P<0.05）（圖5），說(shuō)明果實(shí)提取物能夠顯著降低高脂膳食誘導(dǎo)小鼠肝臟組織TG 和T-CHO 含量。

圖5 櫻桃李提取物對(duì)小鼠肝臟TG、T-CHO 含量的影響Fig.5 Effect of Prunus cerasifera Ehrh.extract on TG、T-CHO in liver of mice

2.8 櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用熒光定量PCR 檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明櫻桃李果實(shí)提取物組小鼠肝臟PPARγ、FAS、SREBP-1c 和C/EBP-α 基因表達(dá)與HFD 組相比顯著降低（P<0.05）（圖6），說(shuō)明櫻桃李果實(shí)提取物能顯著降低高脂膳食誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪的形成和積累。

圖6 櫻桃李提取物對(duì)小鼠肝臟mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Prunus cerasifera Ehrh.extract on mRNA in liver of mice

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中，采用水提法獲得紫果櫻桃李果皮和果肉粗提物中總多酚含量為105.74 mg/g，對(duì)DPPH 自由基的體外清除率為81.07%。大量的試驗(yàn)證明，富含多酚的天然產(chǎn)物具有降脂功能[11-14]。本研究通過(guò)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型，研究富含多酚的櫻桃李果汁的降脂效果。通過(guò)測(cè)定小鼠體重，血清及肝臟中甘油三酯、總膽固醇含量，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期攝入高脂肪食物使小鼠體重明顯增加，血清和肝臟中脂質(zhì)含量明顯升高。櫻桃李果汁可使肥胖小鼠體重減輕，降低血清和肝臟中脂質(zhì)含量。

SOD 在維持機(jī)體的氧化-抗氧化平衡中起重要的作用。本研究表明，櫻桃李果實(shí)提取物能顯著增強(qiáng)高脂膳食小鼠肝臟SOD 活性，提高肝臟的抗氧化能力。正常情況下血清中AKP、ALT/GPT、AST/GOT 含量低，當(dāng)肝臟發(fā)生病變損傷后血清中相關(guān)酶活力升高。本研究結(jié)果顯示，櫻桃李果實(shí)提取物能夠顯著降低高脂膳食小鼠肝臟AKP、ALT/GPT、AST/GOT 活力。表明食用櫻桃李能顯著降低長(zhǎng)期攝入高脂食物對(duì)小鼠肝臟的損傷。

為更深入地了解櫻桃李果實(shí)提取物的抗肥胖作用，研究了脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。PPARγ 和C/EBPα 是參與脂質(zhì)代謝的許多基因的調(diào)控因子[15]，食用櫻桃李提取物導(dǎo)致PPARγ 和C/EBPα的表達(dá)下調(diào)。SREBP-1c 是調(diào)節(jié)脂肪合成和脂肪酸氧化的上游轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控下游脂肪酸合成酶FAS 的表達(dá)[16]，食用櫻桃李提取物抑制SREBP-1c、FAS 的表達(dá)，小鼠血清和肝臟TG 含量顯著降低，表明SREBP-1c 基因表達(dá)改變可能是TG 含量降低潛在的機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，櫻桃李果實(shí)提取物可以抑制脂肪生成基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肥胖的發(fā)作。綜上所述，櫻桃李果實(shí)提取物對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠肥胖具有預(yù)防作用。櫻桃李果實(shí)多酚含量和抗氧化活性均較高，可以作為開(kāi)發(fā)降脂功能性食品的良好資源。該研究仍需進(jìn)一步對(duì)果實(shí)中多酚進(jìn)行純化，對(duì)組分進(jìn)行鑒定，并對(duì)調(diào)控脂代謝相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行深入研究。